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    HotStart Bst4.2 大規格(125ml包裝酶)

    簡要描述:

    HotStart Bst4.2 大規格(125ml包裝酶)公司正在出售的產品:宮頸癌細胞 磷化結蛋白封閉多肽 牛腺病毒通用PCR檢測試劑盒 大鼠內皮抑(ES)試劑盒 ELISA 果糖1,6二磷醛縮(FBA)活性比色法檢測試劑盒 中國臺灣別樣海源菌 BCL7B蛋白抗體

    更新時間:2024-01-12

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    HotStart Bst4.2 大規格(125ml包裝酶)

    商品屬性:

    產品名稱

    規格

    貨號

    HotStart Bst4.2 大規格(125ml包裝酶)

    100U

    A-PJ1007



    Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 經酶電子重構架和進化篩選(in silico Design & invitro Evolution),其為Bst4.0 的升級品,通用于 DNA 或 RNA 的 LAMP 或RT-LAMP 擴增。
    性能提升包括 :

    (1 )Bst 4.2 全系包含 熱啟動Aptamer,該配體確保酶在<30℃時,酶活封閉效率>95%,在>60℃時 1min 內釋放酶活。該特性利于室溫建立反應體系,并大幅降低了低溫條件下的非特異擴增;

    (2)反應溫度提升到 70℃,大幅降低引物 Dimer 的形成,提高擴增特異性,并使得粗樣品核酸釋放更加充分;

    (3)全系包含 Helicaser,因此,允許在不使用 F3/B3 引物的情況下進行 LAMP 擴增(easy LAMP),并允許 FIP/BIP 的引物用量降低一倍。這將進一步降低非特異擴增,并使得擴增均一性大幅提升。
    image.png

    注意: HotStart Bst 4.2 DNA/RNA Polymerase(8U/μl)不含有甘油,可用于凍干體系的建立。
    QQ截圖20240110094643.jpg儲存:長期保存請置于-20℃以下(12 個月有效);制品反復凍融 10 次不影響性能,但應避免反復凍融;制品由于含有高濃度的糖組分,-20℃保存的酶制品,在融化時可能會有結晶物,此時在 30℃的溫度下融化,過高的溫度可能會導致熱啟動性能下降。一經融化推薦置于 2-8℃保存,在此條件下制品穩定儲存 6 個月。
    特殊說明:
    (1) Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 在用于 LAMP 擴增時的推薦反應溫度為 65-70℃,最佳反應溫度為 70℃。因此其可替代  的 Bst4.0 系列,用于標準 LAMP的擴增。
    (2) 由于 反應溫度為 70℃,因此在進行eLAMP 擴增時,反應溫度為 70℃。
    1. 標準 LAMP 擴增
    1.1 10xLAMP Primer Mix:FIP/BIP=16 μM each; LF/LB=4
    μM each; F3/B3=2 μM each
    1.2 配制 LAMP 反應體系
    10xBst4.2 Buffer(Mg2+ free) 2.5 μl
    100mM Mg2+
    1.5 μl
    dNTP Mixture(10 mM each) 3 μl
    10xLAMP Primer Mix 2.5 μl
    HotStart Bst 4.2(8U/μl) 1 μl
    模板 DNA/RNA X μl
    ddH2O 到總體積 25 μl
    1.3 反應體系配好后,置于 65-70°C 反應 20~30min。
    2. eLAMP 擴增
    2.1 10xeLAMP Primer Mix : FIP/BIP=8 μM each;
    LF/LB=4 μM each。
    注意:eLAMP(easy LAMP)為去除 F3/B3 引物的方法,為 Bst4.2 系列專用的使用策略,對于大多數引物組,在Helicaser 的加持下,擴增速度幾乎不受影響。如引物擴增效率低,可提高 FIP/BIP 濃度到 12~16uM。
    2.2 配制 eLAMP 反應體系
    10xBst4.2 Buffer(Mg2+ free) 2.5 μl
    100mM Mg2+
    1.5 μl
    dNTP Mixture(10 mM each) 3 μl
    10xeLAMP Primer Mix 2.5 μl
    HotStart Bst 4.2(8U/μl) 1 μl
    模板 DNA/RNA X μl
    ddH2O 到總體積 25 μl
    2.3 eLAMP 的擴增溫度為 70°C,反應 20~30min。
    其它注意事項
    (1) 制品中包含高濃度的鹽組分,使用時做好個人防護,防止制品與皮膚、眼、鼻、呼吸道等接觸和吸入,一旦接觸或吸入,請用大量的清水沖洗。
    (2) 防止氣溶膠污染,盡可能進行分區操作。

    65.jpg

    67.jpg


    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

    公司正在出售的產品:

    人鼻病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

    不透光相關蛋白ELISA試劑盒 OPAs免費代測試劑

    附紅細胞體(嗜血支原體)屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

    基孔肯尼雅病毒PCR檢測試劑盒供應

    遲現抗原4ELISA試劑盒 VLA4免費代測試劑

    甲型流感病毒72亞型PCR檢測試劑盒說明書

    轉基因植物Sad基因PCR檢測試劑盒

    C-型凝集域家族2成員CELISA試劑盒

    貓衣原體PCR檢測試劑盒

    登革熱病毒、PCR檢測試劑盒

    促腎上腺皮質激樣中葉肽ELISA試劑盒

    貓衣原體探針法熒光定量PCR試劑盒

    馬杜拉放線菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    蛋白激BαELISA試劑盒

    產氣莢膜梭狀桿菌B型探針法熒光定量PCR試劑盒

    禽痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

    蛋白體亞基α1ELISA試劑盒

    病毒N3亞型(AIV-N3)核檢測試劑盒

    病毒H7亞型(AIV-H7)核檢測試劑盒

    淀粉樣蛋白β前體樣蛋白2ELISA試劑盒

    皮炎外瓶霉染料法熒光定量PCR試劑盒

    馬爾太蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    端粒延長分子2ELISA試劑盒

    流感嗜血桿菌型PCR檢測試劑盒

    馬疽桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉移14ELISA試劑盒

    凝固陰性葡萄球菌核檢測試劑盒

    禽副粘病毒3PCR檢測試劑盒供應

    法尼基轉移αELISA試劑盒

    貓嗜衣原體PCR檢測試劑盒

    藍氏賈第鞭毛蟲A型探針法熒光定量PCR試劑盒

    人富亮氨α2糖蛋白1(LRG1)檢測試劑盒elisa

    諾氏梭狀桿菌PCR檢測試劑盒

    歐雅病毒核檢測試劑盒

    人假定蛋白LOC677340試劑盒ELISA

    真菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    艾特韋病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    人轉運體樣蛋白4(SLC44A4)ELISA試劑盒

    黑色普雷沃菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    馬爾太蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    U型肌激,線粒體(CKMT1A)試劑盒ELISA

    HotStart Bst4.2 大規格(125ml包裝酶)棒桿菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    豬圓環病毒通用型(PCV-U)核檢測試劑盒

    人補體蛋白3(C3) 試劑盒 ELISA

    皮炎芽生菌PCR檢測試劑盒

     


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