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更新時間:2024-01-12
商品屬性:
產品名稱 | 規格 | 貨號 |
Equi-phi29 DNA Polymerase | 1000U | A-PJ1053 |
Equi-phi29 DNA Polymerase | 10KU | A-PJ1053 |
是 phi29 的改造體,并經多次純化分離而得。在保留了 phi29 DNA 聚合酶的鏈置換、連續合成特性(>70kb)的基礎上,提高了滾環擴增的反應溫度,該酶酶可以在 42 度條件下持續的進行 DNA 合成(而 phi29 DNA 聚合酶在此溫度下反應活性很低)。
這種高溫的反應特性,在以下幾個方面對實驗有明顯的提升:
(1)在 NGS 測序中,其提升了高 GC 含量、回文結構等復雜模板的延伸能力,使得 NGS 的覆蓋度更均一,降低測序所需深度;
(2)高溫的反應條件,提升了基因組 DNA的 WGA 產物的合成量,并可以進行變溫擴增;
(3)降低測序中 Gap 區域,提升單細胞測序的數據質量和完整度;
(4)降低非特異性擴增產物;
(5)提升 MDA/RCA 等實驗的擴增性能和特異性。
除此外,該酶仍然具有很強的 3’→5’外切酶校讀功能,合成的 DNA 片段保真性高。該酶的外切酶活性較強,因此合成過程中引物需要 3’端硫代修飾,以降低外切活性對引物的切割效應。
儲存:-20℃可保存 3 年。
注意:在不同的實驗類型中,Oligo根據實驗需要自行選擇。
2. 引物和模板退火:體系配制完畢后,放置到 PCR 儀中,95℃ 3min,25℃ 3min。3. 退火完畢后,向退火產物中加入 1μl Equi-phi29 DNAPolymerase,混合均勻。
4. 擴增反應
4.1 恒溫擴增
對于環狀DNA模板采用恒溫反應作為推薦使用30℃恒溫擴增,30℃孵育 6~16h.該酶在 30-42℃條件下均可工作,
必要時根據實驗類型進行調整。
4.2 變溫擴增
對于基因組 DNA 或 cDNA 模板,推薦使用變溫擴增反應,以在短時間內獲得更高產量,并提高了低濃度模板的擴增產量。在 PCR 儀上做如下設置:
【30℃ 5min;42℃ 15s】循環 72 次(約 6h)或 120次(約 10h).必要時,反應結束后,可于 65°C 10min 進行失活反應。
使用注意事項
(1)必要時可單獨額外添加終濃度 1 mM DTT 和 0.2mg/ml BSA,可提高反應效率。
(2)該酶的最佳反應溫度為 42 ℃ (在 30~42℃之間均有活性)。
(3)65℃ 10min 即可使該酶失活。
(4)根據實驗類型需要,調整dNTP的濃度100~500 μM。
(5)添加 Yeast Pyrophosphatase可提高 DNA 產量。
(6)反應引物 3’端的硫代修飾可避免引物降解。
PCR基本步驟及注意事項?
一、實驗原理
PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。
在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。
2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
PCR實驗中應該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);
2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。
ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。
因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。
1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;
2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。
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