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    加A聚合酶(E.coli)

    簡要描述:

    加A聚合酶(E.coli)公司正在出售的產品:鼠肝星形細胞 電導鈣激活鉀通道蛋白1封閉多肽 犬皰疹病毒PCR檢測試劑盒 大鼠熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA檢測試劑盒 磷脂C(PLC)活性比色法檢測試劑盒 鼠尾菌 11號染色體開放閱讀框65抗體

    更新時間:2024-01-12

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    加A聚合酶(E.coli)

    商品屬性:

    產品名稱

    規格

    貨號

    A聚合酶(E.coli

    100U

    A-PJ1060

    A聚合酶(E.coli

    1000U

    A-PJ1060

    本 E. coli Poly(A) Polymerase 為高效加 A 聚合酶,該酶以RNA為模板在RNA的3′末端加入20~200個A堿基??蓱糜谠鰪?mRNA 的穩定性,及 microRNA 加 A 尾,為cDNA 合成提供 oligo-dT 引物結合位點等。該酶以單鏈 RNA作為引物,ATP 作為底物進行聚合反應。
    image.png

    活性定義:
    在 37℃、pH7.9 的條件下,以 ATP 為底物,10 分鐘內把1 nmol 的 AMP 聚合到 RNA 上所需要的酶量定義為 1 個活性單位(U)。
    應用:
    RNA 3' 標記
     microRNA 加 A 尾,為 cDNA 合成提供 oligo-dT 引物結合位點
     增強 RNA 穩定性
    儲存:-20°C 可保存 2 年。
    熱失活條件:65°C 20 min
    image.png

    2. 混合均勻后,37°C 反應 1 小時。即可用于后續實驗。注:不同的實驗需要加 A 的量會有所不同,可通過減少反應時間來調整加 A 的長度,該酶在 37°C 反應 30 分鐘時可加30 個 A 堿基,1 小時可加 100 個 A 堿基。

    QQ截圖20240110094643.jpg


    65.jpg

    67.jpg


    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

    公司正在出售的產品:

    小孢子酒曲菌染料法熒光定量PCR試劑盒

    胞漿型磷脂A2-αELISA試劑盒 cPLA2-α免費代測試劑

    丁型肝炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

    病毒PCR檢測試劑盒說明書

    單純皰疹病毒抗原2ELISA試劑盒 HSV-Ag2免費代測試劑

    鼠痘病毒PCR檢測試劑盒供應

    貓瘟病毒(FPV)核檢測試劑盒

    細胞周期HELISA試劑盒

    馬蘇哈魚病毒PCR檢測試劑盒

    呼吸道病毒多重PCR檢測試劑盒

    彈性蛋白3AELISA試劑盒

    馬腺病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

    馬錢子探針法PCR鑒定試劑盒

    低氧上調節因子1ELISA試劑盒

    敗血梭狀芽胞桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    侵入性絲囊霉菌(潰瘍綜合癥病原)探針法熒光定量PCR試劑盒

    丁型肝炎病毒ELISA試劑盒

    綿羊痘病毒(SPPV)核檢測試劑盒

    禽阿爾法皰疹病毒型=馬立克病病毒PCR檢測試劑盒

    多巴胺羥化ELISA試劑盒

    前胡探針法PCR鑒定試劑盒

    馬皰疹病毒4PCR檢測試劑盒

    多肽YYELISA試劑盒

    鏈球菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    馬輪狀病毒PCR檢測試劑盒

    二氫嘧啶脫氫[NADP+]ELISA試劑盒

    牛細小病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

    腔闊盤吸蟲PCR檢測試劑盒

    防御β110ELISA試劑盒

    馬皮疽組織胞漿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    連翅染料法PCR鑒定試劑盒

    人毒蕈堿型乙酰受體M2(mAChRM2)自身抗體試劑盒ELISA

    七星庫道蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

    牛支原體PCR檢測試劑盒

    Na+/H+交換體3(NHE3)elisa試劑盒

    蓋塔病毒探針法熒光定量RT-PCR探針法熒光定量PCR試劑盒

    產氣腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    人超敏熱休克蛋白60(HSP-60)ELISA檢測試劑盒

    偽狂犬病病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

    綿羊莫拉菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    α烯醇化(αENOL) ELISA試劑盒

    A聚合酶(E.coli雞皮刺螨探針法熒光定量PCR試劑盒

    中華鱉虹彩病毒(STIV)核檢測試劑盒

    人成熟促進因子(MPF) ELISA試劑盒

    槍狀肝吸蟲PCR檢測試劑盒

     


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