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  • 產品列表PRODUCTS LIST

    Hi T7 RNA Polymerase

    簡要描述:

    Hi T7 RNA Polymerase公司正在出售的產品:正常大鼠腎細胞 α2巨球蛋白樣蛋白1封閉多肽 犬腺病毒PCR檢測試劑盒 大鼠熱休克蛋白40(HSP-40)ELISA Kit 磷脂A2(PLA2)活性比色法檢測試劑盒 檸檬色赤桿菌 抗腫瘤蛋白ANUP抗體

    更新時間:2024-01-12

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    Hi T7 RNA Polymerase

    商品屬性:

    產品名稱

    規格

    貨號

    Hi T7 RNA Polymerase

    10KU

    A-PJ1058

     對 T7 噬菌體啟動子具有高度的特異性,并可以其作為啟動子,DNA 作為模板體外合成正義鏈。雙鏈線性質粒 DNA、PCR 產物均可作為該酶的底物模板。Hi T7 RNA 聚合酶經電子重構架及庫篩選,與 Wild型比較來看,酶的 DNA 模板結合區域親和力更高,使其具有持續合成能力,從而獲得更高的產量,并易于長片段RNA 的合成。該酶為重組純化制品,無 DNase 和 RNase污染。
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    活性定義:在標準反應體系下,37℃ 1 小時內將 1 nmol的 ATP 摻入酸不溶物所需要的酶量定義為一個活性單位。
    儲存:置于-20°C 可保存 2 年,如有白色沉淀析出,37°C溫浴 5min 后使用,不影響性能。
    熱失活:75°C,10min。65.jpgimage.png

    2. 37℃孵育 2-3h (通常 3h,即可獲得>80 μg 的總產量)。
    3. 反應完畢后,如需去除模板 DNA,加入 Dnase I(2U)37℃處理 15min。
    4. 終止反應:75℃加熱 10min,或加入 2 μl 0.5M 的 EDTA(pH8.0)。
    注意事項
    1.質粒DNA的質量影響RNA的量和完整性。質粒DNA的濃度越高,生成RNA的質量越高,質粒模板DNA應該無RNase污染.
    2.該酶為高產酶,RNA 產量高,在反應完畢后,通常存在肉眼可見的渾濁狀態,其為反應副產物焦磷酸鎂,此時表明反應劇烈。在下一步 RNA 純化前,可通過短暫離心去除沉淀物,此過程并不丟失 RNA。
    3. 通常轉錄后 RNA 產物濃度在 2-4 μg/μl,因此電泳時,僅需取 0.05-0.1 μl 即可。

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    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

    公司正在出售的產品:

    禽白血病病毒B亞群染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

    苯諾龍/苯去甲ELISA試劑盒 NP免費代測試劑

    環形泰勒蟲染料法熒光定量PCR試劑盒

    腦多頭囊蟲PCR檢測試劑盒直銷

    單純皰疹病毒型抗體IgGELISA試劑盒 HSVⅡ-Ab免費代測試劑

    多子小瓜蟲PCR檢測試劑盒說明書

    牛結核分歧桿菌(MB)核檢測試劑盒

    細胞周期FELISA試劑盒

    馬梭菌PCR檢測試劑盒

    漢坦病毒PCR檢測試劑盒

    ELISA試劑盒

    馬隱秘桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

    馬皰疹病毒3型染料法熒光定量PCR試劑盒

    低密度脂蛋白受體相關蛋白2ELISA試劑盒

    溶組織梭狀桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    秦艽探針法PCR鑒定試劑盒

    凋亡抑制因子5ELISA試劑盒

    布氏桿菌(BS)核檢測試劑盒

    禽白血病病毒PCR檢測試劑盒

    ELISA試劑盒

    前病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

    馬皰疹病毒2型探針法熒光定量PCR試劑盒

    多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉移7ELISA試劑盒

    鏈球菌組PCR檢測試劑盒

    馬流產沙門氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    二氫嘧啶樣2ELISA試劑盒

    牛瘟病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

    茄病鐮刀菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    防御α6ELISA試劑盒

    馬乳頭瘤病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

    利什曼原蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    人端粒重復序列結合因子1(TERF1)試劑盒ELISA

    普通變形桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    瘧原蟲PCR檢測試劑盒(PCR 熔解曲線法)

    CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBPα)ELISA試劑盒

    杰米斯頓病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    腸粘附性大腸桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

    人成纖維細胞生長因子10(FGF10)檢測試劑盒elisa

    假單胞菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    牛眼莫拉氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    α酮戊二脫氫(α-KGDHC)ELISA試劑盒

    Hi T7 RNA Polymerase小隱孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

    壞死性肝胰腺炎細菌(NHPB)核檢測試劑盒

    人超氧化物歧化(SOD)ELISA檢測試劑盒

    羌蟲病立克次氏體PCR檢測試劑盒

     


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