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    RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表達感受態

    簡要描述:

    RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表達感受態公司正在出售的產品:豚鼠肺成纖維細胞 EIF1AD蛋白封閉多肽 產氣莢膜梭狀芽孢桿菌型PCR檢測試劑盒 大鼠嗜性粒細胞陽離子蛋白(ECP)ELISA試劑盒 肉桂醇脫氫(CAD)活性比色法檢測試劑盒 紅色糖多孢菌 21號染色體開放閱讀框56抗體

    更新時間:2024-01-12

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    RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表達感受態

    商品屬性:

    產品名稱

    規格

    貨號

    RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表達感受態

    10T

    A-PJ1094

    描述:BL21(DE3) Chaprone 感受態細胞中含有分子伴侶蛋 白質粒,其表達產物可協助重組蛋白正確折疊形成可溶活性 蛋白。分子伴侶蛋白質粒為抗性(chloramphenicol, Cmr)的表達受控于四環素(tetR)操縱子,因此該感受態 不適用于抗性表達質粒的轉化。 本品使用  的化學感受態技術制備, 其室溫可保存 3 天、-20°C 可保存 2 年(推薦保存溫度)、 -80°C 可長期保存性能無下降。運輸過程中無需干冰,可常 規冰袋運輸(推薦運輸溫度)。該感受態細胞為熱激感受態 細胞,轉用于蛋白表達(不可用于克隆和載體構建),經 42°C 熱激 1min 可獲得 105~106 cfu/μg 效價,可滿足質粒轉化要 求。該制品使用簡單、運輸、儲存方便。 

    QQ截圖20240110094643.jpg組分
    RTS BL21(DE3)Chaprone Competent Cell(10T) 1 瓶
    Nano E.coli Transfection Reagent 1 mL
    儲存:RTS 系列感受態為干粉形式,均可室溫保存 3 天,長期保存-20°C(2 年)。經 Nano E.coli Transfection Reagent溶解后的感受態必須分裝后,并于-60°C 以下保存。溶解后的感受態細胞避免反復凍融,在-60°C 以下可保存 6 個月。
    操作方法
    1. 從-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent融化,放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli TransfectionReagent 加入到一支凍干感受態細胞中,并分裝到 10 支 1.5ml EP 管中(每支 30 μl),于-60°C 以下保存(或立即使用)。
    2. 將 10~100 ng 質粒 DNA(不可使用連接產物、不可使用篩選標記質粒)加入到分裝的感受態細胞中,輕彈EP 管(或槍頭輕輕吹打),置于冰上 15min。
    3. 置于 42°C 熱激 1 min 后,迅速置于冰上急冷 2 min。
    4. 熱激完畢后,向上述感受態細胞中加入 450 μL 不含抗生素的 SOC(或 LB)培養基,37 °C 振蕩(225 rpm)培養60 min。使質粒上抗性標記基因表達,菌體復蘇。
    5. 取200 μl復蘇菌液涂布到含相應抗生素的LB瓊脂平板表面。(含相應質??股睾?20 μg/ml )
    6. 將平板置于 37 °C 培養,12~18 小時后可出現菌落。
    7. 挑選生長良好的菌落,接入 LB 培養基(含相應質??股?,20 μg/ml),37 ℃劇烈振蕩培養過夜。
    8. 1/50 比例接入新的 LB 培養基(含相應質??股?,20μg/ml ,0.5 mg/ml L-阿拉伯糖)37 ℃劇烈振蕩培養至菌體密度 OD600 約 0.3(約 2h)。
    9. 加入終濃度 2 ng/ml 四環素(誘導 chaprone 伴侶蛋白表達),37℃劇烈振蕩培養至 OD600 約 0.5(約 2~4h)。
    10. 加入適量 IPTG(0.1-1 mM), 15℃振蕩培養 24h(培養搖床無法制冷條件下,室溫誘導 8~12h)。
    11. 4,000 rpm 室溫離心 15 min,收集細胞,進行蛋白表達和可溶性表達分析。



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    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

    公司正在出售的產品:

    卵形瘧原蟲染料法熒光定量PCR試劑盒

    艾柯病毒IgGELISA試劑盒 ECHO IgG免費代測試劑

    雞毒支原體探針法熒光定量PCR試劑盒

    貝氏隱孢子蟲PCR檢測試劑盒說明書

    蛋白二硫化物異構A3ELISA試劑盒 PDIA3免費代測試劑

    腦膜炎奈瑟菌群PCR檢測試劑盒說明書

    弧菌O(VC O)核檢測試劑盒

    半胱氨蛋白抑制劑6ELISA試劑盒

    馬立克氏病病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

    金葡萄球菌耐藥基因PCR測定試劑盒

    蛋白酪氨磷ⅣA3ELISA試劑盒

    馬立克氏病病毒3型染料法熒光定量PCR試劑盒

    貓杯狀病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

    動力蛋白激活蛋白2ELISA試劑盒

    查菲艾利希體探針法熒光定量PCR試劑盒

    蒲公英探針法PCR鑒定試劑盒

    多巴胺β羥化ELISA試劑盒

    對蝦白斑病毒(WSSV)核檢測試劑盒

    普氏立克次氏體PCR檢測試劑盒

    多藥耐藥相關蛋白ELISA試劑盒

    禽波氏桿菌 染料法熒光定量PCR試劑盒

    曼氏桿菌通用PCR檢測試劑盒PCR檢測試劑盒

    二氫嘧啶樣蛋白3ELISA試劑盒

    里氏埃里希氏體PCR檢測試劑盒價格

    ubiquitine 基因核檢測試劑盒

    泛結合E2C結合蛋白E2L3ELISA試劑盒

    諾如病毒4PCR檢測試劑盒價格

    偏肺病毒PCR檢測試劑盒

    非受體型蛋白酪氨磷6ELISA試劑盒

    馬疥螨PCR檢測試劑盒

    流感病毒H13亞型PCR檢測試劑盒(熒光PCR法)

    人蛋白酪氨磷1B(PTP1B)試劑盒ELISA

    禽病毒性關節炎PCR檢測試劑盒

    牛呼腸孤病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    人特異性巨噬細胞武裝因子(SMAF)ELISA試劑盒

    草魚呼腸孤病毒2型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    產腸毒性大腸桿菌O139血清型染料法熒光定量PCR試劑盒

    人表皮生長因子受體2(sp185/Her2)檢測試劑盒elisa

    呼吸道合胞病毒PCR檢測試劑盒

    牛分枝桿菌PCR檢測試劑盒

    β-連環蛋白(CTNNB1/CTNNB/OK/SW-cl.35/PRO2286)ELISA檢測試劑盒

    RTS BL21(DE3)Chaprone助溶表達感受態鴨腺病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

    腸道病毒EV(EV-)核檢測試劑盒

    人促甲狀腺釋放激(TRH)ELISA試劑盒

    禽副粘病毒型PCR檢測試劑盒

     


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