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    pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒

    簡要描述:

    pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒公司正在出售的產品:狗肺成纖維細胞 重組小鼠GFRAL蛋白 假結核棒桿菌PCR檢測試劑盒 大鼠髓系細胞觸發受體-1(TREM-1)試劑盒 ELISA 性蛋白活性比色法檢測試劑盒 產酮古洛糖菌 糖基轉移8結構域1抗體

    更新時間:2024-01-12

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    pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒

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    貨號

    pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒

    1 kit

    A-PJ1109

    描述:本試劑盒所包含的原核表達載體(pCold-SUMO-10His)是在 pCold-SUMO 載體基礎上改造而成,

    該載體啟動子(CS Promoter)來源于南極嗜冷細菌,在低溫下(15 度)才能啟動蛋白的表達。低溫下細菌生長緩慢,使得蛋白合成速度減慢,從而最大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率,提高了蛋白可溶性表達,增強了活性蛋白的表達比率。該表達系統所包含的 SUMO tag 可以極大地提高小分子量蛋白的表達量,而且進一步提高了蛋白的可溶表達幾率。同時,TEE 信號肽可增強冷啟動子調控下目的蛋白的高表達。
    改進后的 pCold-SUMO-10His 載體,其 SUMO 蛋白標簽含有 10 個組氨標簽(10His tag),使其結合 Ni-NTA 的能力更強。與較早版本的 pCold-SUMO 表達系統相比,pCold-SUMO-10His 表達系統在保留了原有統的蛋白可溶性能生產能力、高特異性剪切能力的情況下,對 Ni-NTA 結合能力的得到明顯提高。其對 Ni-NTA 結合能力的提高,

    QQ截圖20240110094643.jpg在以下三個方面改善了生產重組蛋白的性能:

    (1)提高了粗蛋白樣品中目標蛋白的捕獲能力,從而提高純化產量;

    (2)在蛋白純化過程中可以
    使用更高濃度的咪唑進行漂洗,去雜蛋白的能力明顯提升,從而獲得更高純度的重組蛋白;

    (3)在重組蛋白酶切去除 SUMO標簽后,利用 Ni-NTA 去除 SUMO 標簽更為,獲得純度更高的無標簽目標蛋白。
    關于宿主菌的使用:本試劑盒配備了兩種宿主表達菌感受態細胞,Lyophilized Arctic (DE3)感受態和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受態,兩種感受態均為凍干品形式可長期保存在-20℃,效價無明顯下降(2~10X10e5 cfu/μg)。
    通常在質粒載體的構建完成,并測序驗證后,可將重組質粒轉入該感受態進行蛋白表達。該宿主菌僅為蛋白表達生產用,不可以進行載體構建和質粒的提取制備。由于 pCold-SUMO 系統的高可溶性表達特性,在大多數情況下重組蛋白在 LyophilizedArctic (DE3)感受態即可獲得理想的可溶表達,因此實驗請選用 Lyophilized Arctic (DE3)感受態宿主菌。

    在 LyophilizedArctic (DE3)感受態宿主菌可溶表達效果不理想的情況下,再選用操作相對復雜的、帶有輔助折疊伴侶分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌,該系統可獲得最佳的可溶表達。除此外,pCold-SUMO 系統在常規 BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌內均可獲得可觀的可溶性表達。
    關于蛋白酶的使用:試劑盒配備了 SUMO 蛋白酶(酵母來源,也稱為 UIP 蛋白酶)和 rTEV 蛋白酶,在第一步載體構建過程中需要評估、考慮兩個蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶識別蛋白結構,切割活性高、酶切,對于需要去除 Tag的重組蛋白其是。個別情況下 SUMO 標簽的結構會受到 C 端重組目標蛋白的影響,使得 SUMO 蛋白酶對重組融合蛋白的切割效率降低、甚至是無效,此時再選用 rTEV 蛋白酶進行酶切。由于 rTEV 蛋白酶識別氨基酸序列,個別重組融合蛋白會包埋識別序列,因此也會導致蛋白酶切效率下降。由于重組融合蛋白結構的無法預測性,因此在實驗過程中兩種蛋白酶的酶切均需要測試。無論如何,通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率。本試劑盒配備的 SUMO 蛋白酶可以識別 SUMO標簽結構(SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG)切割位點位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有雙 His 標簽,保證了 SUMO 蛋白酶高親力的結合 Ni-NTA,以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶(分子量約 26kD)。rTEV 蛋白酶可以識別 SUMO 標簽后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列,并在識別位點 Gln-Gly(QG)之間進行切割,從而去除 SUMO 標簽。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 標簽(分子量約 30kD),可使用 Ni-NTA 純化介質去除。
    本試劑盒配備的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 為蛋白表達陽性質粒,該質粒含有 43kD 的目標蛋白,其與SUMO 標簽(19kD)融合后分子量約為 62kD。該表達質粒在 Arctic (DE3)中即可獲得良好的表達。其可以僅可做為表達、酶切實驗的陽性對照品。



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    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

    公司正在出售的產品:

    禽腺病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

    β血小板球蛋白ELISA試劑盒 β-TG免費代測試劑

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    蛋白聚糖3ELISA試劑盒 PRG3免費代測試劑

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    廣州管圓線蟲(AC)核檢測試劑盒

    囊性纖維化跨膜傳導調節因子ELISA試劑盒

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    馬紅球菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    貓皰疹病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

    端粒重復結合因子2ELISA試劑盒

    長鼻分咽線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

    蜱傳腦炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

    多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉移11ELISA試劑盒

    草魚出血熱病毒(GCHV)核檢測試劑盒

    破傷風梭狀桿菌PCR檢測試劑盒

    二甲基精氨二水解1ELISA試劑盒

    禽傳染性支氣管炎病毒荷蘭株染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

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    法尼基轉移αELISA試劑盒

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    貓弓形蟲PCR檢測試劑盒

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    派琴蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    分揀連接蛋白10ELISA試劑盒

    馬杜拉放線菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    流感嗜血桿菌B型探針法熒光定量PCR試劑盒

    人乙酰轉移(ChAT)試劑盒ELISA

    禽痘病毒PCR檢測試劑盒

    牛病毒性腹瀉病毒PCR檢測試劑盒(熒光PCR法)

    人水蛭(HRD)elisa試劑盒

    三代蟲染料法熒光定量PCR試劑盒

    腸道病毒A組探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    人百日咳病毒抗體(IgM)ELISA檢測試劑盒

    白堊立克次氏體探針法熒光定量PCR試劑盒

    海魚分枝桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    β乳糖蛋白抗體IgG 試劑盒 ELISA

    pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒腸致病性大腸桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    鴨源性成分(Duck)核檢測試劑盒

    人催產(OT)試劑盒 ELISA

    病毒H5/H9亞型(AIV-H5/H9)核檢測試劑盒 (雙重熒光PCR)

     


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