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    Western一抗二抗通用稀釋液

    簡要描述:

    Western一抗二抗通用稀釋液公司正在出售的產品:小鼠精母細胞 20號染色體開放閱讀框50封閉多肽  茹拉巴德古柏線蟲PCR檢測試劑盒 大鼠髓過氧化物特異性抗中性粒細胞胞質抗體IgG(MPO-ANCA IgG)ELISA Kit 水樣中六價鉻離子(Cr6+)濃度活性比色法檢測試劑盒 白蟻菌 谷肽硫轉移C段結構域抗體

    更新時間:2024-01-12

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    Western一抗二抗通用稀釋液

    商品屬性:

    產品名稱

    規格

    貨號

    Western一抗二抗通用稀釋液

    100ml

    A-PJ1107

    QQ截圖20240110094643.jpg


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    生產的 Western 一抗二抗通用稀釋液用于做 Western blot 實驗時一抗或者二抗的稀釋。用本稀釋液稀釋的一抗或者二抗使用后,可放在 4℃或者-20℃保存,并且可以反復多次使用,節約您寶貴的抗體。按照每個一抗稀釋10ml 計算,該 Western 一抗稀釋液可以稀釋 10 個或 10 次Western Blot 雜交實驗。該制品中不含有抑制熒光顯色或HRP 顯色的成分。應用:Western blot 實驗時一抗或者二抗的稀釋
    儲存:-20℃ 可保存 3 年。開始使用后請于 4℃保存,有效期為 1 年。
    使用方法:
    1. 進行一抗孵育雜交參考所用的一抗說明書,以及樣品中目的蛋白的含量,使用本抗體稀釋液按照適當比例稀釋一抗,如 1:1000、1:500 等,一抗稀釋后即可直接用于 Western blot 實驗(室溫孵育雜交1h 或 4℃雜交過夜)。實驗結束后,可以回收稀釋的一抗,4℃或-20℃ 保存,以用于下次的 Western blot 實驗。
    2. 進行二抗孵育雜交進行完一抗孵育后,TSBT 溶液洗滌膜 1~2 次,同樣參考二抗說明書,使用本抗體稀釋液,進行二抗的稀釋,并進行二抗的孵育雜交(通常二抗雜交時間為室溫 30min 即可)。雜交完畢后 TBST 洗滌膜 3~4 次,并進行下游顯色。PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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