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    熱敏雙鏈DNA特異性核酸酶(HL dsDNase)

    簡要描述:

    熱敏雙鏈DNA特異性核酸酶(HL dsDNase)公司正在出售的產品:家貓肺成纖維細胞 白細胞介13受體a2封閉多肽 克里米亞剛果出血熱病毒PCR檢測試劑盒 大鼠糖化血紅蛋白A1c(GHbA1c)ELISA試劑盒 糖原含量活性比色法檢測試劑盒 水赫夫勒氏菌 卵黃狀黃斑病蛋白2抗體

    更新時間:2024-01-14

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    熱敏雙鏈DNA特異性核酸酶(HL dsDNase)

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    熱敏雙鏈DNA特異性核酸酶(HL dsDNase)

    100U

    A-PJ1114

    熱敏雙鏈DNA特異性核酸酶(HL dsDNase)

    1000U

    A-PJ1114

    QQ截圖20240110094643.jpg

    熱 敏 雙 鏈 DNA 特 異 性 核 酸 酶 (Heat labileds-DNA-specific Nuclease ,又名 ezDNase 或 HLdsDNase),為雙鏈特異性核酸酶。其特異性的識別降解雙鏈 DNA,對單鏈 DNA 或 RNA 幾乎無活性,其降解 dsDNA的能力比 ssDNA 高~5000 倍。除此外,該酶降解雙鏈 DNA的能力比 bovine DNaseI 高~30 倍,因此特別適用于去除RNA 樣品中的基因組 DNA 污染。該熱敏型雙鏈 DNA 核酸酶可將 DNA 降解為 2~8bp 的產物,且 55℃ 5min 可使該酶不可逆失活,同時又能保持 RNA 和 ssDNA 的穩定性。除此外,本酶適合于,對基因組樣品進行酶法片段化反應。

    儲存:-20℃ 可保存 3 年。
    活性定義: 1 單位指 25°C 條件下 15min 將 10μg 基因組DNA 消化至 80%的產物<500bp,所需的酶量。
    使用注意事項
    (1)1×dsDNase Buffer:20mM Tris-HCl pH8, 5mM MgCl2。該酶需要 1~5mM MgCl2。
    (2)該酶對 K+敏感,反應體系中推薦 K+濃度低于 40mM。
    (3)通常在 RT 反應中的用量為 0.1~0.5U/20 μl 體系。
    (4)任何濃度的 SDS、鹽酸胍均抑制該酶活性。
    (5)該酶的最佳反應溫度為 25~37℃,42℃ 30min 后活性損失 70%。
    使用實例 1(對基因組 DNA 進行片段化反應)
    1. 按以下組分配制反應體系
    基因組 DNA 10 μg
    10×dsDNase Buffer 2.5 μl
    HL dsDNase (2 U/μl) 0.5-1 μl
    Rnase Free H2O Up to 25 μl
    2. 室溫 25°C 孵育 15min,55~65°C 5min 加熱失活。
    使用實例 2(基因組 DNA 的去除)
    1. 按以下組分配制反應體系
    基因組 DNA 1 μg
    10×dsDNase Buffer 2.5 μl
    HL dsDNase (2 U/μl) 1 μl
    Rnase Free H2O Up to 25 μl
    2. 室溫 25°C 孵育 30min,55~65°C 5min 加熱失活。此時
    基因組 DNA,通常 90%以上的產物被消化至<15bp

    65.jpg


    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    67.jpgPCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

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