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    一步法miRNA反轉錄試劑盒

    簡要描述:

    一步法miRNA反轉錄試劑盒公司正在出售的產品:猴孤雌單倍體胚胎干細胞 上皮細胞粘附分子(CD326)封閉多肽 豬瘟病毒PCR檢測試劑盒 大鼠腎(Renin) ELISA Kit 葡萄糖6磷(6PG)活性比色法檢測試劑盒 意大利小海員菌 艾滋病病毒抗體

    更新時間:2024-01-12

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    一步法miRNA反轉錄試劑盒

    描述:由于 miRNAs 分子序列較小,僅 20nt 左右,沒有 真核生物有的 Poly(A)尾巴結構,采用傳統 Oligo dT 引 物和隨機引物很難獲得從 miRNA 到 cDNA 的反轉錄產 物。 公司開發出一套全新的加 A 法 miRNA 反轉 錄試劑盒,基于 Peter 改良的 miR-Q 技術, 可以對成熟的 miRNA 同時完成加 A 反應和反轉錄反應, 直接獲得含有特異性 tag 和 15(T)的 cDNA 產物(如圖 1 所示)。該方法使得 miRNA 反轉錄與 mRNA 的反轉錄一 樣輕松。直接將提取的 miRNA 與反應緩沖液混合物混合, 并置于 PCR 儀上 1 小時即可獲得高濃度的、包含所有 miRNAs 分子的 cDNA 產物。獲得的 cDNA 產物適用于 HG miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進行定量檢測,該方法 已被大量文獻所采用。 

    儲存:請置于-20°C,可保存 2 年;避免反復凍融
    操作方法
    1. 按以下組分配制反轉錄反應液
    miRNA(0.01-0.1 μg)or Total RNA 0.1-2 μg
    4×One step miRNA RT Solution 5 μl
    *10×miRNA RT Primer 2 μl
    Rnase Free H2O Up to 20 μl
    *特別說明: 10×miRNA RT Primer 引物為
    5’-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’,定量擴增
    用特異性上下游引物進行擴增,圖 2 是以 hsa-miR-21 為
    實例說明特異性上下游引物的設計方法
    2. 在 PCR 儀上按以下條件進行反應:
     37°C 60min
     95°C 5min
    3. 獲得 cDNA 產物后使用 HG miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進行 miRNA 定量檢測。

    公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

    貨號

    產品名稱

    規格

    A-PJ1084

    一步法miRNA反轉錄試劑盒

    25T

    A-PJ1084

    一步法miRNA反轉錄試劑盒

    100TX20μl

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    PCR 反應需要使用哪些試劑和設備?

    試劑:
    模板DNA:PCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調節反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準,用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產物;
    設備:
    PCR儀:用于控制反應溫度,保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是,只有在有序齊全的基礎上,才能進行PCR反應并得出準確結果。

    PCR相關基礎實驗:

    PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成,每個循環包括以下3個步驟:

    一、變性:

    利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

    二、退火或稱接合,復性:

    在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

    三、延伸:

    DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

    PCR反應條件優化:

    1、變性溫度和時間:

    保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

    2、復性溫度和時間:

    PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高,產物特異性越高。復性溫度越低,產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

    3、延伸溫度和時間:

    一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間,可根據待擴增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

    4、循環數:

    其他參數選定后,PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后,PCR產物的積累即可達到最大值,實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多,非特異擴增增加。

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