HG TaqMan miRNA定量PCR試劑盒

描述：HG TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒， 采用特異性的正向 miRNA 引物和接頭引物進行 PCR 擴 增，檢測熒光基團采用 FAM 標記的特異性 miRNA TaqMan 探針（原理見圖 1）。使用該試劑盒可以特異性、 高靈敏度的檢測低至 100 個細胞的 miRNA 分子。 的 TaqMan miRNA 定量 PCR 試劑盒共有一萬 余種，每一個 mircoRNA 分 子對應一個檢測試劑盒（包含特異性的 TaqMan 探針、正 向引物、反向引物、定量試劑），可在 HG TaqMan miRNA qPCR kit.xls 中查詢。如果您研究的 mircoRNA 分子不在 我們的列表中，請來信咨詢，我們將及時給您優化設計。 內參基因可選擇使用： （1）TaqMan RNU6B miRNA 定量 PCR 試劑盒適用于人、鼠等哺乳動物組織、細胞樣品； （2）TaqMan hsa-miR16 miRNA 定量 PCR 試劑盒適用于來源于人、鼠全血樣品。

組分：

儲存：避光置于-20°C，可保存 2 年；避免反復凍融
1 配制反應體系(20μl)
5×Golden HS TaqMan qPCR Mix 4 μl
20×miRNA TaqMan Assay 1 μl
*cDNA 模板 1～2.5 μl
ddH2O Up to 20 μl
2 進行 Real-Time PCR 反應
通常采用兩步法，程序如下：
 Stage 1: 95℃ 15 min（熱啟動，不可縮短時間）
 Stage 2: 95℃ 10 s
 60℃ 30 s 40cycles
（收集信號采用 FAM 染料通道，Rox 矯正信號選擇 None）
3 反應結束后確認 Real-Time PCR 的 cDNA 樣品和 NTC
陰性對照的擴增曲線。

公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成，每個循環包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環數:

其他參數選定后，PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多，非特異擴增增加。

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