HG TaqMan miRNA反轉錄試劑盒公司正在出售的產品:果蠅胚胎細胞 血紅結合蛋白1封閉多肽 嗜衣原體通用PCR檢測試劑盒 大鼠(EPI)ELISA檢測試劑盒 蘋果合(MS)活性比色法檢測試劑盒 磚紅海水桿菌 9號染色體開放閱讀框59抗體
更新時間:2024-01-12
商品屬性:
產品名稱 | 規格 | 貨號 |
HG TaqMan miRNA反轉錄試劑盒 | 25T | A-PJ1081 |
HG TaqMan miRNA反轉錄試劑盒 | 100TX20μl | A-PJ1081 |
描述: TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒采用加 A 法進行反轉錄,加 A 法的反轉錄效率遠高于莖環法,因 此,采用該方法可極大的提高檢測靈敏度(原理見圖 1)。 該試劑盒操作簡單,僅需要兩步即可輕松完成 miRNA 的 cDNA 合成,合成的 cDNA 可用于所有 miRNA 的后續定 量檢測。反轉錄完畢后采用特異性的上游引物和接頭引物 進行 PCR 擴增,FAM 標記 TaqMan 探針作為熒光報告基 團進行定量檢測(原理見圖 1)。 TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒專用于 miRNAs 分子的反轉錄試驗,轉錄獲得的 cDNA 產物用于 TaqMan 定量 PCR 方法檢測 miRNAs 分子
儲存:請置于-20°C,可保存 2 年;避免反復凍融
操作方法
1 按以下組分在 0.2 ml EP 管中配制應液
miRNA (5~100 ng/μl) 4 μl
5×TaqMan miRNA RT Solution A 1 μl
注意:不建議使用 Total RNA,Total RNA 試驗結果通常差
于 miRNA。
2 在 PCR 儀上按以下條件進行加 A 反應:
37°C 30min
85°C 5min
3 反應完畢后,在上述 5μl 反應體系中加入如下試劑,并
混合均勻。
10×TaqMan miRNA RT Primer 2 μl
10×TaqMan miRNA RT Solution B 2 μl
H2O 11 μl
4 在 PCR 儀上按以下條件進行反轉錄反應:
30°C 5min
55°C 60min
95°C 5min
獲得的 cDNA 產物可用于多個目標 miRNA 的檢測。反轉錄完畢后獲得的 miRNA cDNA,可加入 20~80μl ddH20 稀釋2~5 倍,通常取 2μl 即可用于 HG TaqMan miRNA 定量 PCR試劑盒檢測。
PCR基本步驟及注意事項?
一、實驗原理
PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。
在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。
2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
PCR實驗中應該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);
2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。
ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。
因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。
1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;
2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。
公司正在出售的產品:
點狀古柏線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒 | 白介2誘導的T細胞激ELISA試劑盒 ITK免費代測試劑 | 動物雙歧桿菌Bb-12探針法熒光定量PCR試劑盒 |
克里米亞出血熱病毒PCR檢測試劑盒直銷 | 彈性蛋白微原纖維界面因子1ELISA試劑盒 EMILIN1免費代測試劑 | 分枝桿菌屬通用PCR檢測試劑盒說明書 |
草魚出血熱病毒(GCHV)核檢測試劑盒 | 親環DELISA試劑盒 | 馬虻探針法熒光定量PCR試劑盒 |
甲、乙型流感病毒2聯PCR測定試劑盒 | 蛋白激BαELISA試劑盒 | 馬虻染料法熒光定量PCR試劑盒 |
麥冬探針法PCR鑒定試劑盒 | 淀粉狀蛋白βELISA試劑盒 | 網尾線蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒 |
氣管比翼線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒 | 端粒重復結合因子2相互作用蛋白ELISA試劑盒 | 狂犬病毒(RV)核檢測試劑盒 |
氣腫疽梭狀桿菌PCR檢測試劑盒 | 多肽-N-乙酰氨基半乳糖轉移3ELISA試劑盒 | 禽白血病病毒B亞群染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 |
馬胃葡萄球菌探針法熒光定量PCR試劑盒 | 二甲基甘氨脫氫ELISA試劑盒 | 立克次氏體通用探針法熒光定量PCR試劑盒 |
馬泰勒梨形蟲PCR檢測試劑盒原 | 泛醌蛋白1ELISA試劑盒 | 瘧原蟲通用型核檢測試劑盒 |
普雷沃菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒 | 防御β134ELISA試劑盒 | 馬鏈球菌馬亞種PCR檢測試劑盒 |
鄰單胞菌通用PCR檢測試劑盒說明書 | 人低密度脂蛋白受體相關蛋白4(LRP-4)抗體(IgG)ELISA試劑盒 | 侵襲性大腸桿菌PCR檢測試劑盒 |
牛皰疹病毒通用探針法熒光定量PCR試劑盒 | 人喋呤(MTX)檢測試劑盒elisa | 鵝星狀病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 |
蝦肝腸微胞蟲探針法熒光定量PCR試劑盒 | 人玻連蛋白(VTN)試劑盒ELISA | 棘盤瑞氏絳蟲PCR檢測試劑盒 |
非洲分枝桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒 | 人β淀粉樣多肽42(Aβ 42)試劑盒ELISA | HG TaqMan miRNA反轉錄試劑盒反芻獸艾利希體探針法熒光定量PCR試劑盒 |
結核桿菌(TB)核檢測試劑盒 | 人雌激(E)試劑盒 ELISA | 禽波氏桿菌PCR檢測試劑盒 |