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    血清血漿microRNA提取試劑盒

    簡要描述:

    血清血漿microRNA提取試劑盒公司正在出售的產品:兔皮膚成纖維細胞 NF-κB活化激封閉多肽 鸚鵡熱嗜衣原體PCR檢測試劑盒 大鼠神經營養因子4(NT-4)ELISA檢測試劑盒 胼胝質含量活性比色法檢測試劑盒 海神單胞菌 FAM78B蛋白抗體

    更新時間:2024-01-12

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    血清血漿microRNA提取試劑盒

    公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

    貨號

    產品名稱

    規格

    A-PJ1080

    血清血漿microRNA提取試劑盒

    25T

    A-PJ1080

    血清血漿microRNA提取試劑盒

    100T

    描述:血清血漿 miRNA 提取試劑盒是目前提取小 RNA(<200nt)操作步驟簡單、重復性最好、小 RNA 產 率最高的方法之一。使用該試劑盒通過一步上柱即可獲得高 純度 miRNA,可在 10min 左右完成小 RNA 的提??;且使用 該試劑盒提取的小 RNA(Small RNA)中,長度在 15~200nt 范圍的 RNA 在 95%以上,基本不含有大 RNA 和 DNA,可 直接用于后續的反轉錄、Northern 雜交、測序等應用。

    儲存:室溫可保存 2 年。
    使用防護建議:Serum/Plasma miRNA Reagent 溶液中含有胍鹽,其具有強烈的腐蝕性,試驗時請務必佩戴防護眼鏡、手套、口罩等防護措施,如有皮膚接觸請立即用大量清水沖洗,再另行就醫。
    自備試劑:異丙醇、乙醇、75%異丙醇、2ml EP 管
    操作方法:
    (1) 向 1.5ml EP 管中加入 800μl Serum/Plasma miRNAReagent。將 300μl 血清或血漿樣本加入到上述 800μlmiRNA Reagent A 中,用腕力混勻 30s,室溫放置 5min。
    (2) 13,000rpm 離心5min,將上清約 1ml 吸入到新的 2ml EP管中。加入 1ml 異丙醇,上下顛倒混合均勻。
    (3) 將上述溶液分三次加至吸附柱中(每次約 700μl),13,000rpm 離心 15s,倒掉過柱液。
    (4) 向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次,13,000rpm離心 15s,倒掉過濾液。
    (5) 向吸附柱中加入 500μl 無水乙醇洗滌一次,13,000rpm離心 15s,倒掉過濾液。
    (6) 吸附柱 13,000rpm 空離心 2min,去掉殘留的乙醇。
    (7) 將吸附柱放入到新 1.5ml EP 管中,室溫放置 2min,使殘留乙醇揮發。在吸附柱濾芯上加入 30μl RnaseFree H2O,室溫靜置 2min,13,000rpm 離心 2min,洗脫產物即為提取的 miRNA。
    常見問題匯總:
    (1) 由于血清血漿中的 miRNA 含量極低,提取的 miRNA 濃度通常在 5 ng/μl 以下,因此難以用常規的 NanoDrop 測量濃度,建議直接使用 10 μl 進行下游反轉錄。由于本試劑盒提取的是小 RNA,該濃度下的 miRNA Copy 數足以進行下游檢測。
    (2) 由于血清血漿中 miRNA 的含量低,為了獲得更可靠的實驗數據,建議使用特異性和靈敏度更好的 TaqMan 探針法進行 miRNA 的下游檢測。本試劑盒提取的 miRNA 并不限于其它檢測方法和用途,包括 SYBR Green 法檢測、二代測序、芯片等檢測領域。
    (3) 血清血漿 TaqMan miRNA 反轉錄試劑盒為血清血漿專用,不可用于細胞和組織的 miRNA 檢測實驗。

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    PCR 反應需要使用哪些試劑和設備?

    試劑:
    模板DNA:PCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調節反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準,用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產物;
    設備:
    PCR儀:用于控制反應溫度,保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是,只有在有序齊全的基礎上,才能進行PCR反應并得出準確結果。

    PCR相關基礎實驗:

    PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成,每個循環包括以下3個步驟:

    一、變性:

    利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

    二、退火或稱接合,復性:

    在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

    三、延伸:

    DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

    PCR反應條件優化:

    1、變性溫度和時間:

    保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

    2、復性溫度和時間:

    PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高,產物特異性越高。復性溫度越低,產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

    3、延伸溫度和時間:

    一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間,可根據待擴增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

    4、循環數:

    其他參數選定后,PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后,PCR產物的積累即可達到最大值,實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多,非特異擴增增加。

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