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    ssDNA/RNA環化連接酶

    簡要描述:

    ssDNA/RNA環化連接酶公司正在出售的產品:中華鱉脾臟成纖維細胞 磷化腺苷單磷活化蛋白激α1封閉多肽 肉毒梭狀芽孢桿菌PCR檢測試劑盒 大鼠生長激釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin) 試劑盒 ELISA 葡萄糖氧化(GOD)活性比色法檢測試劑盒 泊庫島食烷菌 19號染色體開放閱讀框24抗體

    更新時間:2024-01-12

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    ssDNA/RNA環化連接酶

    公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

    貨號

    產品名稱

    規格

    A-PJ1088

    ssDNA/RNA環化連接酶

    2000U

    A-PJ1088

    ssDNA/RNA環化連接酶

    20KU

    描述: ssDNA/RNA CircLigase 為熱穩定的 DNA/RNA 連接 酶,不依賴于 ATP,可催化單鏈 DNA 或單鏈 RNA 的分子內 環化。環化反應中,要求催化底物單鏈 DNA/RNA 具有 5’- 磷酸基團和 3’-OH 基團。對于大于 15nt 的單鏈底物,該酶 都能高效的連接。 

    組分

    活性定義:65°C 1h 條件下,催化 1pmol 5’-磷酸化的 ssDNA
    底物環化,所需的酶量定義為 1Unit。
    儲存:-20℃可保存 3 年。
    6.png反應實例
    1. 按以下組分配制反應液
    CircLigase (100 U/μl) 1 μl
    5’磷酸化 ssDNA/RNA 10-100 pmol
    10×CircLigase Buffer 2 μl
    50mM MnCl2 1 μl
    ddH2O Up to 20 ul
    65°C 孵育 1h 進行環化反應。
    2. 失活反應
    反應結束后,可加入終濃度 10mM EDTA 終止反應?;虿捎?br data-filtered="filtered" style="box-sizing: border-box; margin: 0px;"/>加熱方式 85℃ 10min 加熱失活。
    使用注意事項:
    (1) 環化底物 ssDNA 或 RNA 必須帶有 5’磷酸基團,3’端含有 OH。
    (2) 環化體系中的 ATP 濃度高于 20μM 以上時會極大抑制環化效率,甚至導致環化失敗。因此建議底物為純化產物。
    (3) 由于本酶提高了耐熱性,在 65℃條件下進行連接反應,在測試中 Betain 無益于連接效率提升。
    (4) 本酶主要進行分子內環化連接,分子間的連接未檢測到。
    (5) 本酶對 ssDNA 和 RNA 的環化效率高,多數情況下,90%以上的底物被環化。未被環化的 ssDNA 可通過加入 5U的 Exonuclease I,37°C 消化 15min 去除,以獲得高純度的環化 ssDNA。未環化的 ssRNA,將稍后給出去除方案。
    (6) 本酶可以連接 15nt 以上的核苷酸,更長的產物連接參數,將稍后給出測試報告及 protocol。
    (7) 對于連接底物量較少的實驗來講,推薦縮小體系,而不是減少酶的用量。在小體系實驗時注意體系的蒸發,可加入礦物油以防止蒸發。



    5.png

    PCR 反應需要使用哪些試劑和設備?

    試劑:
    模板DNA:PCR反應需要模板DNA,如從細胞、組織、血液中提取DNA等;引物:PCR反應的兩個引物,分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區域,引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物;dNTPs:PCR反應中需要四種dNTPs,包括脫氧腺苷酸(dATP)、脫氧胸苷酸(dCTP)、脫氧鳥苷酸(dGTP)、脫氧胞嘧啶酸(dTTP),用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程,用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增;Taq DNA聚合酶:PCR反應需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等,用于擴增DNA鏈;PCR buffer溶液:對PCR反應具有緩沖作用,調節反應pH,硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛,可增強PCR反應特異性,從而提高反應效率;酶切體系:PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟,常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準,用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒:用于純化PCR反應產物;
    設備:
    PCR儀:用于控制反應溫度,保證PCR反應時不同溫度環節的嚴格控制;電泳槽:用于分離PCR擴增產物;核酸提取儀:從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是,只有在有序齊全的基礎上,才能進行PCR反應并得出準確結果。

    PCR相關基礎實驗:

    PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環組成,每個循環包括以下3個步驟:

    一、變性:

    利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環之前,通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來PCR儀就控制溫度進入循環階段。

    二、退火或稱接合,復性:

    在DNA雙鏈分離后,降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

    三、延伸:

    DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

    PCR反應條件優化:

    1、變性溫度和時間:

    保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s,再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續時間過長,可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

    2、復性溫度和時間:

    PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高,產物特異性越高。復性溫度越低,產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

    3、延伸溫度和時間:

    一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時,過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合,可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間,可根據待擴增片段的長度而定,小于1kb, 1min足夠;大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意,延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

    4、循環數:

    其他參數選定后,PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環后,PCR產物的積累即可達到最大值,實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%,因此不管模板濃度是多少,20~30次是比較合理的循環次數。循環次數越多,非特異擴增增加。

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