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    T7 gp4A protein

    簡要描述:

    T7 gp4A protein公司正在出售的產品:Wistar大鼠骨髓MSC細胞Wistar大鼠骨髓間充質干細胞 神經突觸1封閉多肽 同艾特韋病毒PCR檢測試劑盒 大鼠維生K1(VK1)試劑盒 ELISA 土壤漆活性比色法檢測試劑盒 地中海中慢生根瘤菌 轉化生長因子β4抗體

    更新時間:2024-01-14

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    T7 gp4A protein

    商品屬性:

    產品名稱

    規格

    貨號

    T7 gp4A protein

    100 ug

    A-PJ1143

    QQ截圖20240110094643.jpg

    描述:

    T7 gp4 蛋白來源于 T7 噬菌體,是其復制系統的一種核心蛋白,它既具有引發酶的作用也具有解旋酶的活性,主要應用于全基因組擴增(WGA),且在擴增環狀全基因組上有非常大的優勢,常用于病毒檢測。 噬菌體T7 基因 4 編碼全長產物 T7 gp4A 蛋白,分子量 63kD,參與噬菌體的 DNA 復制。據文獻報道該蛋白具有 dTTP水解活性,因此具有 5’-3’解旋酶(helicase)活性。本制品為基因工程產物,通過重組表達純化獲得的可溶性產物。

    儲存:-20℃可保存 3 年。
    蛋白保存液:
    20mM Tris-HCl,pH7.5
    200mM NaCl
    5mM DTT
    25%甘油

    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

    65.jpg

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    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    公司正在出售的產品:

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    諾卡菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒

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    禽皰疹病毒通用染料法熒光定量PCR試劑盒

    蒙得維的沙門氏菌PCR檢測試劑盒

    芳基硫酯JELISA試劑盒

    狂犬病病毒通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    梅毒螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒

    紡錘體蛋白2BELISA試劑盒

    破傷風梭狀桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

    牛源性成分PCR試劑盒

    封閉蛋白17ELISA試劑盒

    羅西奧病毒PCR檢測試劑盒

    輪狀病毒 A /B /C 組核檢測試劑盒( 雙重熒光 PCR )

    人成纖維細胞生長因子8(FGF8)檢測試劑盒elisa

    病毒H7亞型PCR檢測試劑盒 (熒光PCR法)

    腦心肌炎病毒(EMCV)PCR檢測試劑盒(熒光-PCR)

    人金葡菌腸毒(SE)試劑盒ELISA

    金黃地鼠白血病病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    馬動脈炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

    人白介-1β前體(Pro-IL-1β)ELISA試劑盒

    都柏林沙門氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    貓支原體PCR檢測試劑盒

    人癌抗原27-29(CA 27-29)ELISA檢測試劑盒

    T7 gp4A protein紅斑丹毒絲菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    人溶菌(hLYZ)轉基因成分核檢測試劑盒

    7α-羥化(CYP7A)ELISA試劑盒

    禽皰疹病毒型PCR檢測試劑盒

     


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