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更新時間:2024-01-14
商品屬性:
產品名稱 | 規格 | 貨號 |
Tte uvrD解旋酶(20ug/ml) | 2ug | A-PJ1162 |
該蛋白來源于耐熱細菌,該蛋白具有熱穩定條件下解旋 DNA 的能力。經 測試,本能解旋 5’突出、3’突出和平端雙鏈 DNA。該酶的解旋活性依賴于輔助因子 ATP 或 dATP。該酶在 45-65℃條件下均有活性,再高
的溫度導致酶失活。該酶具有高的解鏈活性,因子其可潛在的用于 NanoPore測序、芯片雜交、或 tHDA 擴增中,但以上功能 未予測試。
儲存:-20 ℃ 可保存 3 年。
使用注意事項:
(1) 該酶反應液中需要添加 3mM ATP 或dATP 和>2mMMg2+。
(2) 該酶的功能性測試 1xBuffer 為;20mM Tris-HCl,pH7.6,50mM KCl,10mM MgCl2, 3mM ATP。由于應用的差異,本制品不提供反應緩沖液。
(3) 在 20μl 反應體系中,dsDNA 2-5pmol,加入 10-20ng該制品,反應溫度推薦采用 60℃,15-30min。由于底物的長度或類型的不同,實驗可能需要其它參數的調整。
PCR實驗中應該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);
2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。
ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。
因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。
1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;
2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。
PCR基本步驟及注意事項?
一、實驗原理
PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。
在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。
2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
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