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    蝦堿性磷酸酶(SAP)

    簡要描述:

    蝦堿性磷酸酶(SAP)公司正在出售的產品:逆轉錄病毒包裝的NIH3T3細胞 免疫球蛋白j鏈封閉多肽 即腸道病毒型PCR檢測試劑盒 大鼠細胞色P4502E1(CYP2E1) 試劑盒 ELISA 土壤性轉化(SAI)活性比色法檢測試劑盒 禾谷鐮孢 同源盒蛋白B6抗體

    更新時間:2024-01-14

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    蝦堿性磷酸酶(SAP)

    商品屬性:

    產品名稱

    規格

    貨號

    蝦堿性磷酸酶(SAP

    500U

    A-PJ1153

    蝦堿性磷酸酶(SAP

    5000U

    A-PJ1153

    描述:

    蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase,rSAP)催化 DNA 和 RNA 的 5’和 3’磷酸單脂的去磷酸化反應。該磷酸酶在分子生物學研究中應用廣泛,如去除 DNA 和 RNA末端的磷酸基團,用于后續的克隆和探針末端標記。在克隆中,可使線性載體去磷酸化,防止自連。蝦堿性磷酸酶在65°C溫育 5 分鐘即可不可逆的失活,因此,在連接或末端標記之后,可以不用去除熱敏磷酸酶?;谝陨咸匦?,該酶是傳統去磷酸化酶--小牛腸堿性磷酸酶(CIP)的替代物。

    應用
    DNA 和 RNA 的去磷酸化防止克隆載體的自連制備 5′末端標記模板
    儲存:-20℃可保存 2 年。
    活性定義:1 單位指在 37°C 條件下,每分鐘水解 1umol 的pNPP(p-Nitrophenyl Phosphate)到 pNP 所需要的酶量。

    37°C 孵育 30min。65°C 孵育 5min 進行失活反應。
    注意:1 pmol 的 5’末端 DNA,相當于 1 μg 的單酶切質粒 (3kb 大小)。

    QQ截圖20240110094643.jpg


    PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

    沒有ct值

    檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

    1、循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準);

    2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

    3、引物或探針降解??赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

    4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

    5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

    ct值過晚

    在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環, 否則定量不準確。

    因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

    1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

    2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

    3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

    4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

    5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

    65.jpg

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    PCR基本步驟及注意事項?

    一、實驗原理

    PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環開始才產生出和靶DNA區段相同的DNA分子,進一步循環地產生出靶DNA區段的指數加倍。

    在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節循環次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

    二、主要的成分

    1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

    注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

    2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止濃度過大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

    公司正在出售的產品:

    齒垢密螺旋體染料法熒光定量PCR試劑盒

    Z-DNA結合蛋白1ELISA試劑盒 ZBP1免費代測試劑

    人腺病毒D65型探針法熒光定量PCR試劑盒

    糞腸球菌PCR檢測試劑盒說明書

    電壓門控鉀通道ELISA試劑盒 VGKC免費代測試劑

    核型多角體病毒PCR檢測試劑盒說明書

    玉米內源基因IVR核檢測試劑盒

    Dachsous2蛋白ELISA試劑盒

    螺旋體通用PCR檢測試劑盒

    莫氏立克次體PCR檢測試劑盒

    丁型肝炎IgMELISA試劑盒

    瘰疬分枝桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

    密蒙花探針法PCR鑒定試劑盒

    多效調節因子1ELISA試劑盒

    馬疹病病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

    諾卡菌通用染料法熒光定量PCR試劑盒

    二氫嘧啶樣2ELISA試劑盒

    肉毒桿菌B型(CB-B)核檢測試劑盒

    牛錐蟲PCR檢測試劑盒

    泛交叉反應蛋白ELISA試劑盒

    禽嗜血桿菌染料法熒光定量PCR試劑盒

    蜜蜂球囊菌PCR檢測試劑盒

    防御β110ELISA試劑盒

    庫蠓通用PCR檢測試劑盒供應

    獼猴源性成分染料法熒光定量PCR試劑盒

    非小細胞肺癌抗原ELISA試劑盒

    普氏立克次體PCR檢測試劑盒(熒光PCR法)

    牛型放線菌PCR檢測試劑盒

    封閉蛋白8ELISA試劑盒

    輪狀病毒PCR檢測試劑盒

    輪狀病毒B群探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    人超敏前列腺特異性抗原(PSA-U S)ELISA試劑盒

    病毒N亞型(AIV-N)核檢測試劑盒

    腦膜炎奈瑟菌PCR檢測試劑盒供應

    人抗弓形體IgM抗體(anti-toxIgM)檢測試劑盒elisa

    漢扎洛瓦病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

    馬皰疹病毒3型染料法熒光定量PCR試劑盒

    人白喉抗體(Diphtheria Ab)試劑盒ELISA

    哈達爾沙門氏菌探針法熒光定量PCR試劑盒

    人支原體探針法熒光定量PCR試劑盒

    人靶向核糖核(TR)ELISA Kit

    蝦堿性磷酸酶(SAP肝片吸蟲病通用探針法熒光定量PCR試劑盒

    通用/H亞型(AIV-U/AIV-H)核檢測試劑盒

    人膽(Cholic acid)檢測試劑盒elisa

    禽網狀內皮組織增殖病病毒PCR檢測試劑盒

     


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