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    逆轉錄實驗必看重難點分享
    點擊次數:104 更新時間:2024-03-18

    逆轉錄(reverse transcription,是以RNA為模板合成DNA的過程,合成的DNA稱為cDNA。逆轉錄過程遺傳信息的流動方向為RNADNA,與轉錄過程DNARNA的方向相反,故稱為逆轉錄。

    一、實驗原理要素:

    酶促催化使RNA反轉錄為cDNA第一鏈。一條寡聚脫氧核苷酸引物先與RNA雜交,然后由RNA依賴的DNA聚合酶催化合成相應互補的cDNA拷貝,后者能進一步用于PCR擴增。依據實驗的不同目的,針對cDNA第一鏈合成的引物可根據特殊的靶基因設計,或可用隨機引物與所有mRNA雜交。

    實驗要素:

    逆轉錄實驗包括3大要素,分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板:

    1. 引物:

    逆轉錄引物主要有3種,包括 OligodT)、Random Primers 和基因特異性引物(GSP)。其中 OligodT)具有12-20T 堿基,并且與真核生物 mRNA 3Poly A 尾配對,可合成全長的 cDNA,但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ,對模板質量要求高,較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基,可隨機識別模板并結合,適合復雜結構和微量模板,但特異性低,小片段多,適合后續 qPCR 實驗?;蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列,具有特異性強,靈敏度高的特點,但需合成特定的序列。所以根據不同實驗需求可進行相應引物的選擇。

    2. 逆轉錄酶:

    一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV),由兩條肽鏈組成,具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性,它最適溫度是42℃,最適 pH8.3,在高反應溫度時可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙,然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒(M-MLV),是單肽鏈的,有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性,最適溫度37℃,最適 pH7.6,較弱的  RNaseH 活性對獲得2-3kbmRNA 的全長 cDNA 有很大好處。

    3. RNA 模板:

    通常利用紫外分光光度計檢測純度,要求A260/280=1.9~2.1,A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度,完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產生清晰的28S 18S rRNA 條帶(真核樣品),28S rRNA  條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍,并且無 gDNA 和蛋白殘留。

     

    二、實驗流程:

    1. 實驗前準備

    RNA樣品、逆轉錄試劑盒(以諾唯贊R312為例)

    2. 實驗步驟

    ① 試劑化凍后,用手輕彈混勻后短暫離心。

    ② 基因組DNAgDNA)去除:根據RNA樣品的濃度按10pg~1μg計算用量,在RNase-free離心管中依次加入RNase-free ddH2O,5×gDNA Wiper Mix 2μL,RNA樣品,總體系為10μL。用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀,設置反應條件為422min。

    ③ 第一鏈cDNA合成:根據上一步反應管的數量按以下體系在RNase-free離心管中配制預混液:RNase-free ddH2O 5μL,逆轉錄引物(2μM1μL,10×RT Mix 2μL,HiScript II Enzyme Mix 2μL,用移液器吹打混勻后短暫離心。在上一步得到的反應管中每管加入10μL,用移液器吹打混勻后短暫離心。放入PCR儀,設置反應條件為255min,5015min,855min。所得cDNA產物可立即用于qPCR反應或-20℃保存。


    三、注意事項:

    1. 防止RNase污染:保持實驗區域潔凈;操作時需穿戴干凈的手套、口罩;實驗所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free。

    2. 反應液的配制要在冰上操作完成,防止溫度過高造成RNA降解。

    3. cDNA保存時避免反復凍融。


    四、常見問題:

    1. 逆轉錄后的產物可以測濃度嗎?

    不建議測濃度,一般評估RNA模板的質量,需要從濃度、純度及完整性三方面進行考量,但逆轉錄后的產物是一個混合體系,有cDNA、未全逆轉錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分,會干擾cDNA的吸光度,因此不建議用逆轉錄后的cDNA來檢測濃度與純度。

    2. 如何檢測RNA逆轉錄成功與否?

    1) 內參法:理論上,逆轉錄的cDNA是長度不同的DNA片段,所以電泳條帶應該均勻分布在泳道上,如果RNA豐度低,電泳檢測也可能無產物,這種情況通過PCR擴增內參基因,如果有擴增產物,cDNA的質量基本上可以保證(少數情況下:如目的基因片段過長,可能會有例外)。

    2) 已知基因擴增法:如果有已知以此模板擴出來的基因,可以用此基因的引物驗證。能擴增出內參,不一定就說明cDNA沒有問題,因為內參在cDNA中豐度高,容易擴增。如果cDNA因為各種原因導致部分降解,則會大大影響低豐度的目的基因的PCR結果,而內參因為是高豐度基因,擴增很可能不受影響。

    3. 逆轉錄產物中存在gDNA對后續qPCR實驗有何影響?

    cDNA產物中混有gDNA時,cDNAgDNAqPCR反應時會被同時擴增,無法區分熒光信號是來自于cDNA還是gDNA,因此定量結果可能會存在偏差。特別是低表達量的基因,本身的擴增信號低,Ct值大,更加容易受到gDNA污染的影響。在逆轉錄的時候,加一步gDNA去除的步驟,能夠有效降低gDNA污染的影響,增加實驗的可信度。

     


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