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    ELISA實驗洗滌優化關鍵點小結
    點擊次數:166 更新時間:2024-02-19

           優化ELISA的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結合抗體所引起的背景信號,從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結合事件被保留,在最后一步產生信號。而不充分的洗滌會導致差異和高背景,從而帶來不理想的結果。下面將為你介紹一些利用自動洗板機來洗滌ELISA平板的技巧。

           免疫分析,比如ELISA,一般包含兩個或以上的孵育步驟,中間以洗滌隔開。ELISA通常在96孔板中開展,其上包被了結合抗原或抗體。在封閉步驟后,包被后的平板首先與一抗或抗原孵育。隨后通過一些洗滌步驟去除未結合(低親和力)的抗原-抗體復合物。接著,平板與二抗孵育。這種帶有酶的抗體與高親和力的抗原-抗體復合物結合。之后,又是一輪洗滌。最后是添加底物并檢測信號。

    我們可使用多種底物來檢測最終的抗原-抗體復合物。底物分為三類:自然發光、化學發光和熒光。準確說來,ELISA這個詞指的是使用自然發光底物的分析。而使用化學發光底物的分析被稱為Luminescent Immunoassay(LIA),使用熒光二抗的分析被稱為Fluorescent Immunoassay(FIA)。


    1、洗滌參數:

    第一個主要的參數是洗滌量。自動洗板機會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景,那么不要猶豫,將洗滌量調為高,最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到,從而明顯增加背景。所有反應孔的洗滌量必須相同。

    ELISA板的制造商通常會在試劑盒的使用手冊中列出包被量。行業中通常使用的包被量是200µl。如果你的試劑盒也是這樣,那么制造商可能會建議使用300µl洗滌液進行洗滌,以便清潔整個反應孔的壁。一般來說,洗滌量越高,則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。


    2、洗滌次數:

    第二個影響洗滌效果的主要參數是洗滌循環的量。當然,洗滌次數越多,背景越低。然而,太多次的洗滌會降低信號強度,使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復洗滌三次。不過,ELISA板的制造商會對洗滌次數提出建議。一般而言,制造商包被平板需要的洗滌次數比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板,必須優化洗滌次數。

    控制洗滌量和洗滌次數的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說,96孔板的每個孔能容納330至460 µl。不過,有些自動化洗板機可設置程序,分配遠遠超出這個量的洗滌液,比如1 ml。它是如何做到的呢?其實很簡單,就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說,隨著分液器分配更多的液體,抽吸器也將液體吸出。這種技術能增加洗滌量,但不會溢出到其他孔中。


    3、抽吸:

    另外,還有一些參數會影響洗滌步驟的效果。這些參數包括吸液高度和吸入位置,這兩者都能調整,以降低背景(殘留量)和差異。

    殘留液體中包含未結合的抗原或抗體,它們會增加背景信號。殘留量越小,殘留液體越少,轉移到下一步的干擾液體也就越少。

    吸液高度會明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應孔底部的距離稍大,那就會讓殘留量急劇增加。反之,如果洗滌吸頭壓著反應孔底部,那么也會使吸液效率降低,殘留量增加。

    目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭:剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動,而剛性洗頭則固定在適當的位置。使用剛性洗頭的洗滌操作在優化起來更為復雜,因為你需要非常仔細地調整吸液高度。如果你們實驗室使用幾種不同的板,那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時,吸頭會降到反應孔的底部。調整高度就不是很重要,因此洗頭會下降到底部。

    抽吸的位置也對殘留量有著重要影響;如果每個孔只使用一個抽吸點(這很常見,因為更快),那么抽吸的位置需要優化。最佳的位置取決于洗頭的性狀,但它幾乎不在反應孔的中間,即使這是所有洗頭最常見的默認位置。一般來說,最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。

    反應孔的形狀也會影響殘留量。C形底(平底圓角)的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。

    如果沒有自動洗板機,采用手工洗滌,那么也需要注意幾點。使用8道或12道微量移液器,采用倒吸的方法進行洗滌;不同廠家的洗液不宜相互混用。洗板時需保證微孔板平放,將洗滌液注滿各孔,但盡量避免漏液yi液,以每孔300 µl為宜;板洗次數一般為3次,要保證洗板的浸泡時間,每次浸泡時間一般為30-60 秒;盡量減少洗液殘留量,推薦每次洗板后進行拍板,并及時更換吸水紙,避免吸水紙的碎屑粘到反應孔內。

    ELISA看起來很簡單,但是在實際操作過程中,也不能掉以輕心,還是應該仔細檢查洗滌步驟,才能獲得準確的結果。


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