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    免疫組化實驗步驟及問題解答
    點擊次數:194 更新時間:2024-02-05

    免疫組化基本原理是利用抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質),對其進行定位、定性及定量的研究。

    1、脫蠟和水化:脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

      a 、組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘

           b 、無水乙醇中浸泡五分鐘

      c 、95%乙醇中浸泡五分鐘

      d、 75%乙醇中浸泡五分鐘


    2、抗原修復:用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片:

    A 、抗原熱修復

      a 、高壓熱修復: 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液(ph6.0).蓋上不銹鋼鍋蓋,但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上,緩慢加壓,是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘,然后將蓋子鎖定,小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源,置入涼水中,當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

      b、 沸熱修復:電爐或水浴鍋加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6.0)至95℃左右,放入組織芯片加熱10-15分鐘。

      c、 微波爐加熱:在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(ph6.0)至沸騰后將組織芯片放入,斷電,間隔5-10分鐘,反復1-2次。適用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等。

      

    B、 酶消化方法:

    常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃,消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等


    免疫組化問題解答:

      1、染色過強

      a 、抗體濃度過高或孵育時間過長 降低抗體滴度、抗體孵育時間:室溫1小時或4度過夜;

      b、 孵育溫度過高超過37度 一般在室溫20-28度;

      c、 DAB顯色時間過長或濃度過高 顯色時間不超過5-12分鐘,以顯微鏡下觀察為準。


      2、非特異性背景染色

        a、 操作過程中沖洗不充分 每步沖洗3次每次5分鐘;

      b、 組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉孵育時間延長;

      c、 組織中含內原性生物素 正常非免疫動物血清再封閉;

      d、 血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時間。


      3、染色弱

      a 、抗體濃度過低、孵育時間過短 提高抗體濃度、孵育時間不能少 于60分鐘;

      b、 試劑超過有效使用時間 應更換試劑;

      c、 操作中添加試劑時緩沖液未瀝干 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液使試劑稀釋 (應防止切片干燥);

      d、 室溫太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分鐘或4 度冰箱過夜;

      e、 蛋白封閉過度 封閉不要超過12分鐘。


      4、染色陰性

      a 、操作步驟錯誤 應重試 設陽性對照;

      b、 組織中無抗原 設陽性對照以驗證試驗結果;

      c、 一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細確定一抗二抗種屬無誤。



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