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    DNA提取試劑盒試驗必看事項
    點擊次數:285 更新時間:2023-12-18

    一、RNA和DNA提?。?/strong>
    裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異,但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。
    Chaotropes(離液劑)的作用:Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。
    洗滌劑:除了離液劑外,裂解緩沖液中通常還有一些去污劑,以幫助蛋白質溶解和裂解。
    溶菌酶和蛋白酶K:根據樣品類型,也可以使用酶進行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一,實際上在這些變性緩沖液中效果較好;當蛋白質變性增多,蛋白酶 K 的作用也會相應增強。然而,溶菌酶在變性中不起作用,因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進行。

    二、關于質粒制備的注意事項
    分離質粒 DNA 與提取 RNA 或基因組 DNA 的提取方式是不相同的,因為必須質粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻,您加入離液劑將立即釋放所有物質,并且無法將小環狀 DNA 與高分子量染色體區別開來。因此,在質粒制備過程中中,直到裂解后才加入離液劑,鹽用于結合。

    三、DNA 提取后純化:將 DNA 與色譜柱結合
    離液鹽對于裂解至關重要,而且對于將 DNA(或 RNA)與色譜柱結合也是如此。此外,為了增強和影響核酸與二氧化硅的結合,還添加了酒精。
    大多數情況下這是乙醇,但有時可能是異丙醇。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多,你會帶入大量降解的核酸和小物種,這會影響 A260 讀數并降低你的一些產量。太少,可能難以從膜上洗掉所有鹽分。
    如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑,請嘗試使用NaCl 作為沉淀劑,以避免去污劑污染 DNA 或 RNA。

    四、洗滌 DNA(或 RNA)
    當裂解物通過硅膠膜進行離心分離,現在所提取的 DNA 或 RNA 應該與柱子結合,雜質、細胞蛋白和多糖應該已經通過了。
    但是,膜仍然被殘留的細胞蛋白質和鹽弄臟。如果樣品來自植物,仍然會有多糖,也許一些色素留在膜上,或者如果樣品是血液,膜可能會被染成棕色或黃色。
    洗滌步驟用于去除這些雜質。
    通常有兩次洗滌,盡管這可能因樣品類型而異。第一次洗滌通常會含有少量的離液鹽,以去除蛋白質和有色污染物。這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽。
    如果開始的準備工作沒有大量蛋白質,例如質粒準備或 PCR 清理,則只需要乙醇洗滌。去除離液鹽對于獲得高產量和高純度的 DNA 或 RNA 至關重要。一些試劑盒甚至會用乙醇清洗柱子兩次。如果殘留鹽分,核酸的洗脫會很差,A230讀數會很高,導致260/230的比率很低。對于無乙醇 DNA 和 RNA,需要進行干法離心,乙醇洗滌后,大多數方案都有一個離心步驟來干燥柱子。這是為了去除乙醇,對于清潔的洗脫液是必須的。 當將 10 mM Tris 緩沖液或水應用于膜進行洗脫時,核酸會水合并從膜中釋放出來。如果色譜柱上仍有乙醇,則核酸無法全再水合。如果跳過干燥步驟會導致乙醇污染和低產量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度,所以它不會出現在您的讀數中。

    五、RNA 和 DNA 提?。合疵?/strong>
    DNA 提取方案的還剩余IDE步驟步就是從硅膠中釋放純 DNA 或 RNA。
    對于 DNA 制備,通常使用 pH 值為 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱堿性 pH 值下更穩定,在緩沖液中溶解得更快。即使對于 DNA 顆粒也是如此。水的 pH 值往往較低,低至 4-5,并且高分子量 DNA 在用于洗脫的短時間內可能無法全再水合。
    通過在離心前讓緩沖液在膜中停留幾分鐘,可以較大限度地洗脫 DNA。
    由于RNA 易溶于水,且RNA 利于處在微酸性的 pH 值環境下。

    六、RNA 和 DNA 提取實驗中的問題
    1.產量低
    如果您遇到的 DNA/RNA 產量低于您對樣品的預期,則需要考慮許多因素。通常,這是一個裂解問題。不全裂解是產量低的主要原因。它也可能是由不正確的綁定條件引起的。確保使用新鮮的優質乙醇(100% 200 標準)稀釋緩沖液或添加到結合的步驟。劣質乙醇或舊庫存可能已經吸收了水分,并且濃度不正確。如果洗滌緩沖液制備不正確,您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。

    2.低純度
    如果提取的 DNA 被蛋白質污染(低 260/280),那么您可能開始時樣品過多,而蛋白質沒有全去除或溶解。
    如果 DNA 的 260/230 比率不佳,則問題通常是結合或洗滌緩沖液中的鹽分。確保使用最高質量的乙醇來制備洗滌緩沖液,如果問題仍然存在,請再次洗滌色譜柱。
    與其他樣品相比,一些樣品含有更多的抑制劑。環境樣品特別容易出現純度問題,因為腐殖質在提取過程中會被溶解。
    腐殖質的行為與 DNA 相似,很難從硅膠柱中去除。

    3.降解
    降解問題是RNA制備中常常到的問題。因為在 RNA 提取過程中,樣品儲存不當或裂解效率低等情況都會導致降解。對于 DNA 提取,降解不是一個大問題,因為對于 PCR,DNA 可以被剪切并且工作正常,如果不希望有較多剪切的 DNA,可以使用弱裂解的方法。

    七、PCR 清理時的注意事項
    PCR 凈化其實并不是 DNA 提取技術本身,但它是一種效率高且簡單的技術,它只是添加高濃度的結合鹽(通常每體積 PCR 反應 3-5 體積鹽)和離心來過濾。

    在實驗過程中,PCR Clean-up 試劑盒出現故障也會導致整個實驗功虧一簣。
    因為在PCR 反應中有較多吸收 260 度紫外線的物質,比如:核苷酸、去污劑、鹽和引物。所以,PCR 凈化試劑盒經常無法正常工作可能是由于 PCR 反應失敗所造一般成較難清理。


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