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    細胞衰老檢測具體方法
    點擊次數:265 更新時間:2023-12-11

          細胞衰老是細胞在正常環境條件下發生的功能減退、逐漸趨向死亡的現象。衰老的細胞表現為細胞體積變大,呈扁平狀;細胞核變大,核膜內陷,染色質聚集、固縮、裂解;胞質內顆粒增加,有空泡形成;線粒體的數目及形狀發生改變;膜流動性降低;溶酶體內容物增多,導致溶酶體酶β-半乳糖苷酶活性升高。衰老細胞所具有的上述特征成為各種細胞衰老檢測手段的依據。

    其中,對衰老相關β-半乳糖苷酶的檢測是有效檢測細胞衰老的經典方法。X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)是β-半乳糖苷酶的底物,X-Gal本身無色,經β-半乳糖苷酶水解后產生半乳糖和藍色的5-溴-4-氯-靛藍。利用X-Gal的這個特點,可以間接對β-半乳糖苷酶的活性進行測定。衰老細胞中的溶酶體內容物通常增多,使得溶酶體酶β-半乳糖苷酶的活性升高,故可以X-Gal作為底物對細胞衰老的情況進行檢測。

    1、細胞衰老檢測:

    (1)細胞接種前在6孔培養板中預先放置滅菌的細胞片,每孔加入1×10E5個細胞,37℃ 5% CO2條件下培養過夜,使細胞在細胞片上生長。

    (2)在超凈工作臺中吸棄6孔培養板中的培養液,加入×1 PBS,洗滌細胞1次,隨后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液,室溫條件下固定3~5分鐘。

    (3)吸棄2%甲醛/0.2%戊二醛固定液,加入×1 PBS,洗滌細胞3次,每次3分鐘。

    (4)吸棄×1 PBS,加X-Gal溶液以浸沒細胞片為宜,37℃孵育4~8小時或過夜,用保鮮膜包被6孔培養板以防染液蒸發。

    (5)取出細胞爬片,去離子水沖洗2次,再次用固定液固定4分鐘,流水輕輕沖洗。

    (6)將細胞爬片按此順序脫水、透明∶95%酒精I(2分鐘)→95%酒精Ⅱ(2分鐘)→100%酒精I(2分鐘)→100%酒精I(5分鐘)→二甲苯I(2分鐘)→二甲苯Ⅱ(2分鐘)。

    (7)中性樹膠封片。

    (8)在普通光學顯微鏡下觀察衰老細胞形態。

    每張片子鏡下計數400個細胞,確定X-Gal染色陽性細胞(衰老細胞)在細胞群體中的所占的百分比即衰老細胞率(藍染細胞數/總計細胞數×100%)。

    2、細胞衰老檢測注意事項:

    ①X-Gal溶液需要現用現配。

    ②細胞固定時間過長或固定之后清洗不干凈,均會影響后續的酶反應。


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