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    實時定量PCR檢測結果出現異常解析
    點擊次數:324 更新時間:2023-11-13

          實時定量PCR技術(real-time PCR)也叫qPCR(Quantitave PCR),是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程,最后通過特定數學原理對未知模板進行定量分析的方法。下面對實時定量PCR檢測結果出現異常解析:


    1、無Ct值出現

    a)、 檢測熒光信號的步驟有誤:一般染料法采用72℃延伸時采集,探針法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
    b) 、引物或探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性。
    c) 、模板量不足:對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
    d) 、模板降解:避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
    e) 、反應循環數不夠:一般都要在35個循環以上,可根據實驗情況增加循環,但高于45個循環會增加過多的背景信號。

    2、Ct值出現過晚

    a) 、擴增效率極低:優化反應條件,嘗試三步法擴增程序,或者重新設計引物。
    b)、 模板濃度太低:減少稀釋度,重復實驗。
    c)、 模板降解:重新制備模板,重復實驗。
    d)、 PCR產物太長:一般將PCR產物長度設計為100 bp-200 bp之間。
    e) 、反應體系中存在PCR反應抑制劑:一般為加入模板時帶入,導致模板質量不高,加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實驗。

    3、陰性對照出現明顯擴增

    a) 反應體系組分(如水)被污染:實驗過程中,更換新的Mix或者水重復實驗。
    b) 標本間的交叉污染或產物污染:反應體系在超凈工作臺內配制,對實驗室進行嚴格的區分,減少氣溶膠污染;使用帶濾芯的槍頭。
    c) 引物二聚體的出現:引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
    d) 引物濃度不佳:適當降低引物的濃度,并注意上下游引物的濃度配比。在35循環后陰性對照出現擴增屬正常情況,可配合熔解曲線進行分析。

    4、熔解曲線出現多峰

    a)、 非特異性擴增。
    b) 、引物設計不佳:避免二聚體和發夾結構的出現。
    c)、 引物濃度不佳:適當調整引物濃度。
    d) 、退火溫度低:提高退火溫度。
    e)、 模板中有基因組DNA的污染:RNA提取過程中避免基因組DNA的污染(DNaseI處理),或通過設計引物避免非特異性擴增。

    5、出現引物二聚體

    a) 、優化擴增條件,如提高退火溫度,可利用梯度PCR,摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(由95℃變性步驟直接進入60℃退火和延伸步驟)有利于強效擴增,因此引物設計時設定的成功退火溫度為60°C。
    b)、 引物濃度太高,適當降低引物濃度。
    c) 、可通過瓊脂糖凝膠電泳確認引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶,通常位于100 bp以下。

    6、擴增效率低

    a)、 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
    b)、 反應條件不佳:適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
    c)、 反應體系中有抑制物:一般為模板中引入,應先把模板適當稀釋,再加入到體系中,減少抑制物的影響。

    7、實驗重復性差

    a)、 加樣體積失準:使用性能較好的移液槍,擴大反應體積,將模板做高倍稀釋,以大體積加入反應體系中。
    b)、 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致:定期校準儀器。
    c)、 模板濃度太低:模板濃度越稀,重復性越差,減少模板稀釋度或提高加樣體積。
    d)、 qPCR mix沒有混勻,請使用前充分混勻。


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