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    RNA純化過程中需注意的問題
    點擊次數:443 更新時間:2023-09-11

         RNAse的無處不在導致了RNA的脆弱敏感。要改善RNA提取的質量,在RNA純化過程中要特別注意的10個問題介紹。

    1、在收獲組織及細胞死亡之后,應立即滅活內源的RNA酶,以防止RNA降解。以下3個方法均可有效使內源RNA酶失活:
    1)用含離液(如胍鹽)的細胞裂解液收獲樣品,并立即勻漿。
    2)用液氮瞬間凍結樣品。值得特別注意的是:組織塊必須保證足夠小,在浸入液氮的瞬間就能凍結,以確保瞬間令RNA酶失活
    3)立即將樣品置于RNAlater? Tissue Collection: RNA Stabilization Solution中。它是一種水相、無毒的收集試劑,能立即穩定并保護完整、未凍結的組織和細胞樣品中的RNA。關鍵要點是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm),這樣RNAlater才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。

     

    2、使用正確的細胞或組織儲存條件
        在樣品用液氮瞬間凍結之后,應該儲存在-80°C,千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍,也會導致RNA的降解和損失。瞬間凍結的組織應該首先在超低溫條件下先研磨成粉,然后置于裂解液中進行勻漿。

        RNAlater使樣品儲存更為便利。儲存在RNAlater中的細胞或組織可在室溫下穩定保存長達1個星期,在4°C可穩定保存長達1個月,或永jiu 保存在-20°C。有關RNAlater的更多信息請參考 .
     

    3、徹di 勻漿樣品
        細胞或組織的徹di 勻漿對RNA提取來說,是一個很關鍵的步驟,它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應根據細胞或組織的類型來選擇。大部分培養的細胞可以置于細胞裂解液中,通過簡單的渦旋震蕩來勻漿;而動物組織、植物組織、酵母和細菌則常常需要更加劇烈的方法。比如說細菌的細胞壁,就需要酶消化來實現徹di的細胞裂解和RNA的最大回收。有關各種不同的樣本類型,哪些方法是最適he的勻漿方法,請參考 .
     

    4、在RNA提取之前預處理樣品裂解液
        對于某些樣品來說,在勻漿之后,RNA提取之前,還需要一些額外的處理步驟。對于脂肪含量高的組織,像腦組織和脂肪組織得到的裂解液,就需要通過氯仿抽提來去除脂類,從而提高RNA產量。許多植物組織中富含多酚和多糖,會降低RNA的質量和產量,用Plant RNA Isolation Aid 預處理裂解液可去除這些難以處理的成分。
     

    5、選擇最好de RNA分離方法
        現有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前zui 簡單也是zui 安全的方法是柱式分離,如RNAqueous?  或RNAqueous-4PCR Kit。因為操作簡單,所以這些步驟特別適用于同時處理多個樣品。如果是處理復雜的組織,如富含核酸酶(胰腺)或脂肪(腦和脂肪組織)的樣品,就推薦使用更加嚴格的、基于酚處理的RNA分離方法,如ToTALLY RNA?。更多的信息請參考  。更多方法選擇,請參考  
     

    6、DNase處理
        如果提取的RNA將用于RT-PCR,我們推薦用DNase處理純化的RNA樣品以去除殘留的DNA污染。當樣品來源于富含DNA的組織,如脾臟時,DNase處理也是一個好辦法 。RNAqueous-4PCR Kit的實驗流程中包含了DNase處理的步驟,并提供了必需的試劑(DNA酶I)。DNA-free? DNase treatment & Removal Reagents 則可用于去除用各種方法制備的RNA樣品中的DNA污染。這兩個產品都提供了高質量的DNase I,優化的反應緩沖液,和DNA酶消化處理后簡單快速去除DNase的方法,無需使用有機溶劑和熱處理。
     

    7、減少環境RNase的暴露
        為了得到完整的、高品質RNA,在整個RNA制備過程中,當RNA離開強蛋白變性劑(如離液裂解液或酚)的保護時,避免引入新的RNase污染就非常關鍵。由于RNase幾乎是無所bu在,所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣東西都是無RNase污染的。所有的表面,包括移液器、工作臺、玻璃器皿和制膠設備,都必須用表面去污凈化溶液如RNaseZap? 或RNaseZap Wipes 來處理過。必須保證一直使用無RNase的槍頭、試管和溶液,手套也應經常更換。
     

    8、正確的沉淀
        純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮,以滿足一些下游應用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀(加0.1體積的5 M 醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇,-20°C放置25分鐘以上)可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA(ng/ml),可以采用共沉淀(如糖原glycogen,、酵母yeast RNA或linear acrylamide)的方法。當RNA用于RT-PCR分析時,線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑,因為它們都不含DNA污染。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染,有可能影響RT-PCR的結果。沉淀后,注意避免RNA沉淀過分干燥,因為這可能導致很難重新溶解。
     

    9、重懸
        許多RNA提取步驟的最后一步是溶解純化的RNA沉淀。理想的重懸溶液應該滿足3點要求:無RNase污染、較低的pH值(pH 6-7)、含有螯合劑,以保護RNA不受帶入的RNase的降解。(THE RNA Storage Solution能滿足以上所有標準。)為了幫助溶解,RNA沉淀可置于重懸溶液中在65°C孵育5分鐘,并不時輕搖以幫助溶解。
     

    10、儲存
        如果只是短期儲存,重懸的RNA應放置于-20°C;如果是長期儲存的話,就應該放置于-80°C。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲存在-80°C,但保存于醋酸銨/乙醇溶液中的RNA沉淀則更加穩定。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會避免反復凍融損傷RNA,并預防偶然的RNase污染。


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