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    蛋白質純化膠體過濾法步驟
    點擊次數:442 更新時間:2023-08-28

        不同大小的蛋白質分子進入膠體過濾管柱,可依其分子量差異分離;是一種廣泛應用的partition色析法(Pharmacia操作手冊,GelFiltration)。

        儀器設備:色析管柱(PharmaciaCcolumn,1.6×100cm)、鐵架、鐵夾及水平儀;部分收集器(fractioncollector,需準備干凈試管約100支);濃縮用離心機(低速5,000rpm);濃縮用離心管Centriprep-30(Amicon4322)請注意其使用方法

        藥品試劑:膠體SephacrylS-300(Pharmacia):a.預先以緩沖液bufferA-150平衡好,并且使wan全沈降后的膠體體積,占全部體積的七至八成;要先預估好膠體的使用量。b.膠體溫度要與操作場所的溫度一致,否則溫度變化會產生氣泡。c.Sephacryl系列膠體有相當大的吸附力,因此要在緩沖液加入0.15M以上的NaCl以除去非專一性吸附。BufferA-150:注意使用時的溫度要與管柱膠體的溫度一致標準分子量組合(Bio-Rad151-1901):溶于1mL后每組取0.4mL.含有thyroglobulin(670kD),bovinegammaglobulin(158kD),chickenovalbumin(44kD),equinemyoglobin(17kD),vitaminB12(1,350)

        方法步驟:
        1、管柱裝填:

        1)、以純水沖洗玻璃管柱(以純水上下沖洗即可,嚴禁使用試管刷);并請了解管柱的構造與拆裝方法,垂直架好管柱,以軟管連接部分收集器,并以bufferA-150試看管路是否通暢;可以用止血鉗或長尾文書夾夾住出口軟管,則可控制溶離的進行。注意系統的擺設要適當,不要裝置于交通要沖。

        2)、依預估量取出Sephacryl膠體,注意膠體的溫度與緩沖液是否已平衡;將瓶中的膠體上下震蕩,使的wan全懸浮,但勿產生太多氣泡。

        3)、在管柱內加入約10cm高緩沖液,然后將膠體慢慢沿著管壁倒入管柱,一直加到管柱頂端,開始流洗后膠體沈降很快。當膠體上方的液面逐漸降低時,可于頂端添加膠體,以達所要高度;膠體高度約90cm.

        4)、膠體wan全沈降后,小心以bufferA-150加滿管柱,關閉出口,裝上頂端端蓋并連通緩沖液瓶,打開出口以重力流洗。調整緩沖液瓶高度,使流速約每五~六秒一滴,并設定收集體積為2.5mL/tube.

        5)、膠柱流洗約100mL后,關閉出口,拆開頂端端蓋,先以滴管吸出膠體上方的溶液到剩約1cm高,注意勿破壞膠體表面平整;然后打開出口,使液面下降至膠體面,再關閉出口,準備注入樣本。

       二、 樣本色析進行:

        6)、以微量移液器或滴管吸取樣本(樣本體積不得超過膠體總體積的3%),沿著膠體上方管壁緩慢加入,注意切勿破壞膠體的平整表面?。颖敬_實體積_______mL)

        7)、打開出口,同時開啟部分收集器;當樣本wan全沒入膠體時,關閉出口,緩緩加入與樣本相等體積的bufferA-150,打開出口待其慢慢進入膠體中,如此重復二次。不得擾動膠體表面,造成凹陷。

        8)、暫時關閉出口,將液面高度加滿至管柱頂端,并把頂端端蓋鎖上;然后打開出口開始溶離,調整緩沖液瓶的高度,使流速為6s一滴。

        9)、要留心觀察前面幾個分劃,確定整個系統運轉無礙,小心部分收集器最容易出問題。管柱預計將流洗過夜,收集約80管。

        10)、收集試管,進行蛋白質定量分析以及GUS活性測定,并請作圖。

        11)、收集GUS活性區,以Centriprep-30濃縮至10mL后,加bufferA-0稀釋至20mL,再次濃縮至_______mL(GF),保留100μL.

        12)、管柱請再以bufferA-150流洗100mL后,小心放置一旁,準備以后進行分子量測定。

        三、分子量測定:

        13)、進行分子量測定前一天,請先以bufferA-150流洗100mL,并檢查膠柱內有無氣泡產生,若有嚴重的氣泡或干裂,必須重新裝填管柱。

        14)、取標準分子量溶液0.4mL,加上純質目標酶0.5mL(以親和層析法所得的AF部份),如上法注入管柱中,立刻開始進行膠體過濾,并收集各分劃。請依循上述所有管柱及分劃收集器的操作要點。

        15)、收集所得,進行蛋白質定量分析,可定出數個蛋白質尖峰,以作為分子量依據;另以目測法,決定紅色高峰的管數,則可定出vitaminB12的溶離管數。利用以上數據,可畫出分子量與溶離管數間的直線關系,作為分子量判定的標準校正線。

        16)、同樣的一批分劃,請進行酶活性分析(GUS),則可定出酶的溶離體積,對照上述標準校正線,則可求出酶的分子量。

       四、 拆除管柱及保存膠體:

        17)、若管柱長期不用,應當自管柱中取出膠體,以緩沖液清洗后,置冷藏室中保存,但絕對不要放在冷凍箱中。膠體若裝填太緊,有時可能不易取出,要有耐心地以緩沖液慢慢沖出來。

        18)、膠體可以加0.01%NaN3防止霉菌生長,但使用前記得要洗去;再度使用時,請檢查膠體中有無灰黑色霉菌顆粒,若有結塊而不易打散者,也不要使用。

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