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    ELISA試劑盒中各HRP底物操作說明
    點擊次數:664 更新時間:2023-06-05

       ELISA試劑盒中HRP底物范圍較廣,HRP即辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase)比活性高,穩定,分子量小,純酶容易制備,所以zui 常用。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關鍵成分,對試劑盒的質量有重要影響。HRP底物主要包括二氨基聯苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

    一、二氨基聯苯胺/金屬鹽

    DAB是辣根過氧化物酶最敏感、常用的底物。它產生強烈的棕色產物,在水和醇中不溶解。多數情況下,推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中,辣根過氧化物酶可以更加敏感。此類反應產物呈暗藍灰色至黑色,且在水及醇中穩定。DAB/金屬鹽染色應用的組織染色范圍較廣。

    1.     需要的溶液和特殊設備

    DAB,0.05 mol/LTris緩沖液(pH7.6), 0.3% (W/V) 氯化鎳/水貯存液, 30%過氧化氫, DPX, 光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果).

    2.     操作步驟

    (1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris緩沖液(pH7.6)溶解6 mg DAB;

    (2) 加 l mL 0.3%(W/V)氯化鎳/水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代);

    (3) 加0.1 mL 3%過氧化氫。過氧化氫一般以30%的溶液提供,貯存在4 ℃,此條件可以持續1個月;

    (4) 如果出現沉淀,用濾紙過濾;

    (5) 加此溶液至標本,并孵育1~20 min水洗終止反應;

    (6) 優化:如果需要可復染;

    (7) 用DPX封片。


    二、氯萘酚

    氯萘酚可以形成一種藍黑色產物。敏感性低于DAB,且產物可溶于醇中。它適用于當DAB反應形成較高背景或要求改變產物的顏色。

    1.     需要的溶液和特殊設備

    0.03%氯萘酚,用無水乙醇溶解(貯存在-20℃),0.05 mol/LTris(pH7.6),過氧化氫,Gelvatol或者Mowiol,光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。

    2.     操作步驟

    (1) 氯萘酚貯存液的準備:用10 mL無水乙醇溶解0.3 g氯萘酚,貯存于-20℃;

    (2) 加100 μL 氯萘酚貯存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6);

    (3) 加0.1 mL 3%過氧化氫于水中。過氧化氫一般是以30%的溶液提供,4℃可存放1個月;

    (4) 白色沉淀可用濾紙過濾去除;

    (5) 加此溶液到標本中,并在室溫孵育10~40 min,水洗終止反應;

    (6) 優化:如果需要,進行復染,但只可使用水溶性染料;

    (7) 用Gelvatol或者Mowiol封片。


    三、氨乙基咔唑

    氨乙基咔唑(AEC)產生紅色產物,其敏感性低于DAB,但可用于DAB反應產生較高背景或要求改變產物顏色的實驗。此產物可溶于醇,但不溶于水。

    1.     需要的溶液和特殊設備

    0.4% AEC用 N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解, 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.2),過氧化氫, Gelvatol或Mowiol,光學顯微鏡(通常帶有照相機以便于記錄結果)。

    2.     操作步驟

    (1) 用 l mL DMF溶解 4 mg AEC。AEC在DMF中穩定,因此,可以用100 mL DMF溶解0.4 g AEC作為貯存液備用;

    (2) 加 l mL AEC溶液至15 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.2)中,并攪拌;

    (3) 加0.15 mL 3%過氧化氫于水中。過氧化氫一般是30%的溶液提供,在4℃可存放1個月;

    (4) 用濾紙過濾;

    (5) 加此溶液到標本中,并于室溫孵育10~40 min,水洗終止反應;

    (6) 優化:如果需要復染,只可用水溶性染料;

    (7) 用Gelvatol或Mowiol封片。


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