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    實驗干貨,PCR反應常見問題分述
    點擊次數:526 更新時間:2023-05-15

    聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR反應常見問題分述如下:

    1.假陰性,不出現擴增條帶
    PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量, ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
    模板:

    ①模板中含有雜蛋白質,

    ②模板中含有Taq酶抑制劑,

    ③模板中蛋白質沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,

    ④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。

    ⑤模板核酸變性不徹di。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應固定不宜隨意更改。
    酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。
    引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:

    ①選定一個好的引物合成單位。

    ②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。

    ③引物使用過程中應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。

    ④引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

    Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
    反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20μl、30μl、50μl或100μl,應用多大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20μl后,再做大體積時,一定要重新摸索條件,否則容易失敗。
    物理原因:溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率;退火溫度過高,影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下PCR儀或水浴鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
    靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。

    2.假陽性
    引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。
    靶序列或擴增產物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:

    ①操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣器內或濺出離心管外。

    ②除了酶及其他不耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應一次性使用。

    ③必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥唇?,與引物互補后,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

    3.出現非特異性擴增帶
    PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:一是引物與靶序列不wan全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多有關。其次,是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶的量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有:

    ①必要時,重新設計引物。

    ②減低酶的量或調換另一來源的酶。

    ③降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。

    ④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸,也叫兩步法)。

    4.出現片狀拖帶或涂抹帶
    PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過大或酶的質量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。其對策有:

    ①減少酶的量,或調換另一來源的酶。

    ②減少dNTP的濃度。

    ③適當降低Mg2+濃 度。

    ④增加模板量,減少循環次數


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